چالش‌های آزمایشگاهی تشخیص عفونت‌های قارچی
دکتر محمد قهری
www.ghahri.ir
- آزمایش هیستوپاتولوژیک بافت‌ها برای نشان دادن حضور ارگانیسم قارچی، یک ابزار مهم در تعیین معنی‌دار بودن کشت‌هایی است که مثبت شده‌اند؛ بدین معنی که تهاجم قارچی در بافت‌ها و عروق نشان داده می‌شود و نیز واکنش بافتی نسبت به قارچ، مورد ارزیابی قرار می‌گیرد، همچنین در شرایطی که ارگانیسم قارچی رشد نکرده و یا دستور (درخواست انجام) کشت داده نشده، تنها راه فراهم‌شده برای تشخیص است.
- در آزمایشگاه هیستوپاتولوژی به‌طور معمول از رنگ هماتوکسیلن– ائوزین استفاده می‌شود.
- در چه شرایطی از رنگ‌های PAS و GMS استفاده می‌شود؟
1- بعد از مطالعه بافت در رنگ‌آمیزی هماتوکسیلن و آشکار شدن شواهدی که عفونت قارچی را مطرح کند که شامل نوع پاسخ التهابی میزبان، حضور ساختمان‌های قارچی، تهاجم عروقی و هموراژ، ترومبوز و نکروز است.
2- حتی در غیاب شواهد هیستولوژی در رنگ‌آمیزی هماتوکسیلن نسبت به حضور عفونت قارچی تردید کلینیکی وجود داشته باشد.
مروری سریع بر برخی از خطاهایی که ممکن است در آزمایش‌های هیستوپاتولوژی رخ دهد
- طبقه‌بندی اشتباه در کیس‌ها:
- اگر پاتولوژیست در طبقه‌بندی ارگانیسم‌های قارچی تأکید بر روی جنس (صرفاً بر اساس مرفولوژی میکروسکپی) داشته باشد، ممکن است دچار خطا شود.
- هرگاه پاتولوژیست از یک ترمینولوژی نامناسب استفاده کند که طی آن دیگر کپک‌ها در تشخیص افتراقی قرار نگیرند.
- کم‌اطلاعی و یا تجربه‌ی ناکافی از حضور تقلیدگرها یا فرم‌های دروغین مرفولوژیکی فرم‌های مخمری و هایفی وجود داشته باشد.
- هنگامی‌که عناصر قارچی به تعداد کم تاشده و پیچ‌خورده و یا نکروتیک (اثر عوامل ضدقارچی) در نمونه وجود داشته باشند ممکن است اشتباه در طبقه‌بندی حاصل شود.
- کلینیسین‌ها نیز باید آگاه باشند که در آزمایش هیستوپاتولوژیک در حداقل 20% موارد اشتباه در طبقه‌بندی رخ می‌دهد.
- موارد بسیار کمی وجود دارند که خصوصیات مرفولوژیکی قارچ در بافت اختصاصی باشد.
- راه جلوگیری از این‌گونه خطاها:
- عناصر قارچی که در نمونه مشاهده می‌شوند باید به‌دقت توصیف شوند و از ارائه یک تشخیص اختصاصی اجتناب شود. برخی گروه‌ها استفاده از گزارش‌های قالبی یا الگومانند را توصیه می‌کنند. یک نمونه از این الگوهای مورد بحث در زیر شرح داده شده‌اند:
- 1: Hyaline septated hyphae (template)
در صورت مشاهده‌ی هایفی‌های دارای دیواره عرضی و شفاف (تصاویر 1 و 2) می‌توان از الگوی پیشنهادی زیر کمک گرفت.
تصویر شماره 1
تصویر شماره 2
Description: Non-pigmented (hyaline), septated hyphae with acute angle branching.
Diagnosis: Non-pigmented (hyaline), septated hyphae.
Comment: The morphology is consistent with Aspergillus spp., Fusarium spp., Scedosporium spp., Trichoderma spp., Paecilomyces spp. and others. Mucorals genera can sometimes have this morphology.
- 2: Candida spp. (template)
در صورت مشاهده عناصر قارچی مخمری شکل همراه با عناصر هایفی شکل (تصویر 3) می‌توان از الگوی پیشنهادی زیر کمک گرفت.
تصویر شماره 3
Description: Small yeasts (3-5 microns in size) intermingled with pseudohyphae and hyphae.
Diagnosis: Yeasts with pseudohyphae.
Comment: The morphology is consistent with Candida spp., however, Aspergillus spp. and other hyaline fungi can be confused histologically.
- 3: Mucorals genera (template)
در صورت مشاهده‌ی هایفی‌های بدون دیواره عرضی و شفاف (تصاویر 4 و 5) می‌توان از الگوی پیشنهادی زیر کمک گرفت.
تصویر شماره 4
تصویر شماره 5
Description: Non-pigmented (hyaline), pauciseptate ribbon-like hyphae with right angle branching.
Diagnosis: Non-pigmented (hyaline), pauciseptate hyphae.
Comment: The morphology is consistent with Mucorals genera; however Aspergillus spp. and other septated hyaline hyphae can sometimes have this morphology.
معرفی چند نمونه از خطاهایی که در آزمایشگاه پاتولوژی ممکن است بروز نمایند:
بیمار شماره 1:
یک مرد 64 ساله با تعویض دریچه آئورت از یک ماه قبل به اندوکاردیت مبتلا شده و سابقه‌ی کشت خون مثبت با استرپتوکوکوس سانجویس داشته که بمدت 14 روز پنی‌سیلین و جنتامیسین و بدنبال آن بمدت 14 روز دیگر سفتریاکسون دریافت کرده است. دریچه‌ی آئورت خارج‌شده به آزمایشگاه پاتولوژی و میکروب‌شناسی ارسال گردیده و نتایج زیر بدست آمده است:
نتیجه آزمایش‌های هیستوپاتولوژی ارتشاح سلولی هیستیوسیتی شامل تعداد زیادی ماکروفاژهای کف‌دار (foamy) و سلول‌های غول، لنفوسیت‌های پراکنده و مقداری نکروز با التهاب مزمن را نشان داده است. رنگ‌آمیزی هماتوکسیلن– ائوزین ارگانیسم‌های کروی را نشان می‌دهد، اندازه و شکل این ارگانیسم‌ها مطرح‌کننده‌ی عفونت مخمری به‌عوض عفونت باکتریال است (تصویر 6).
نتیجه آزمایش‌های میکروب‌شناسی عدم رشد ارگانیسم‌های باکتری و قارچ را نشان می‌دهند.
تصویر شماره 6
High power photographs of streptococci in vegetations of endocarditis
- A:H&E
- B: PAS
- C: Grocott silver stain of a case with enlarged cocci which didn’t stain with Gram stain
- D: another case of endocarditis showing conventional streptococci staining Gram positive
در این بررسی‌ها مشخص گردید که عناصر مخمری شکل و مشکوک در حقیقت کوکسی‌های کشته‌شده و تغییر‌شکل‌یافته‌ی مربوط به استرپتوکوک تحت تأثیر آنتی‌بیوتیک‌های مصرف‌شده است.
بیمار شماره 2:
1- مرد 54 ساله، به علت ندول‌های سخت در ساق پا مراجعه کرده و بیوپسی تهیه شده فقط به آزمایشگاه پاتولوژی ارسال گردیده است. در گزارش هیستولوژی، فیبروز، التهاب مزمن، نکروز چربی، واسکولیت فوکال و سلول‌های غول و واکنش گرانولوماتوز غیرپنیری دیده شده است. در رنگ‌آمیزی بافت با GMS فرم‌های مخمری جوانه‌دار به ابعاد 3/5 در 4/5 میکرون که عموماً در ناحیه گرانولوم متمرکز شده‌اند، مشاهده گردید (تصویر 7).
تصویر شماره 7: رنگ‌آمیزی GMS. بزرگنمایی 400 برابر
بیمار شماره 3:
مرد 58 ساله مبتلا به COPD شدید وابسته به کورتیکوستروئید با تنگی نفس حاد، تب و درد پلورتیک بستری شد. سابقه پنمونیت نکروزدهنده در قسمت فوقانی لوب راست ریه با لزیون حفره‌ای پایدار داشته است. خلط برای آزمایش و رنگ‌آمیزی از نظر پنموسیستیس کارینی به آزمایشگاه فرستاده شده بود. در آزمایش میکروسکپی سلول‌های مخمری جوانه‌دار با قطر متوسط 4/6 در 3/2 میکرون دیده شدند (تصویر 8).
تصویر شماره 8: منظره خلط رنگ‌آمیزی GMS. بزرگنمایی 400 برابر
بعد از بررسی‌های آزمایشگاهی در مورد موارد شماره 2 و 3 مشخص گردید که رنگ زمینه‌ای لایت گرین آلوده به عناصر مخمری است و این سلول‌های مخمری در حقیقت در رنگ زمینه‌ای لایت گرین رشد کرده بودند (تصویر 9). رنگ زمینه‌ای لایت گرین با pH:3.8 محیطی برای رشد میکروارگانیسم‌ها و از جمله اگزوفیالا جینسلمی است (تصویر 10). اسپورهای زیتونی رنگ این قارچ بعد از رنگ‌آمیزی تقویت شده و سیاه رنگ دیده می‌شدند. اگر ارگانیسم‌ها در نواحیی از بافت بدون واکنش پاتولوژیکال دیده شوند و یا در مقاطع سریال مجاور هم در نواحی متفاوت از یکدیگر مشاهده شوند و یا اینکه فقط در یکی از تکنیک‌های رنگ‌آمیزی دیده شده و در بقیه مشاهده نشوند، باید به آلودگی شک کرد. راهکار اصلاحی برای این دسته از خطاها فیلتر کردن رنگ زمینه‌ای یا سایر رنگ‌ها/ تعویض حمام آب و به‌طورکلی کنترل مواد و محلول‌ها است.
تصویر شماره 9: لام تهیه‌شده از محلول لایت گرین نشان‌دهنده سلول‌های شبه مخمری است. بزرگنمایی 400 برابر
تصویر شماره 10: کشت از محلول لایت گرین و رشد اگزوفیالا جینسلمی. بزرگنمایی 400 برابر
علل بروز اختلاف در نتایج آزمایش‌های هیستوپاتولوژی و کشت
الف- مواردی که نتیجه کشت مثبت اما نتایج پاتولوژی منفی است:
1- قارچی که در محیط کشت رشد کرده یک قارچ کلینیزه شده در بیمار است.
2- قارچی که در محیط کشت رشد کرده یک قارچ آلوده‌کننده در آزمایشگاه است.
3- نمونه‌ی بافت از دو ناحیه‌ی مختلف بدست آمده است: یک قسمت برای پاتولوژی و دیگری برای میکروبیولوژی ارسال شده است.
4- نمونه‌ی پاتولوژی با رنگ‌های اختصاصی و کافی مورد بررسی قرار نگرفته است.
- در این حالت منظره پاتولوژی نمونه باید به‌دقت بررسی شود و محل رویش و تعداد کلنی‌ها در پلیت‌ها بررسی شوند. اگر 1 تا 2 کلنی در محل تلقیح دیده شده و حداقل پاتولوژی در مقاطع بافتی دیده شود احتمالاً قارچی که در پلیت دیده می‌شود یک colonizer است.
- اگر 1 تا 2 کلنی در غیر از محل تلقیح رشد کرده باشد و یافته‌های پاتولوژی در لام حداقل باشد قارچ‌های داخل پلیت آلوده‌کننده هستند.
- ممکن است جراح از دو ناحیه مختلف بافت تهیه کرده است که یکی حاوی قارچ زنده است (و احتمالاً به آزمایشگاه میکروبیولوژی ارسال شده) و دیگری فاقد عناصر قارچی است (که به آزمایشگاه پاتولوژی ارسال گردیده است).
- نمونه ارسالی به آزمایشگاه پاتولوژی ممکن است پاتولوژی مرتبط با عفونت قارچی را نشان نداده باشد و بنابراین پاتولوژیست از رنگ‌های اختصاصی بهره نگرفته است یا اینکه عناصر قارچی بسیار کم بوده و missed شده باشند.
ب- مواردی که نتیجه کشت منفی، اما نتایج پاتولوژی مثبت است:
1- در آزمایشگاه میکروبیولوژی نمونه‌ها بسیار خرد می‌شوند و سلول‌های قارچی نابود می‌گردند.
2- قارچ زنده در نمونه‌ی بافت وجود ندارد.
3- بافت از دو ناحیه مختلف بدست آمده است.
- قارچ‌های کپکی به‌ویژه موکورال‌ها هنگام خرد شدن نابود می‌شوند؛ بنابراین نمونه نباید خرد شود و یا هموژنیزه نشود و قطعات بزرگ‌تر بافت باید مستقیماً کشت شوند.
- نمونه پاتولوژی نشان‌دهنده هایفی با تعداد اندک دیواره عرضی pauciseptate است که با موکورال‌ها سازگاری دارد، در این صورت کشت‌ها باید ظرف 3 روز رشد نشان دهند و آزمایشگاه میکروبیولوژی می‌تواند یک تشخیص فرضی ارائه دهد.
- اگر رشد در طی زمان انتظار بدست نیاید، نتیجه منفی خواهد بود (البته کشت‌ها تا 4 هفته از نظر قارچ‌های دیگری نظیر هیستوپلاسما و پاراکوکسیدیوئیدس نگهداری می‌شوند).
- در عفونت‌های مزمن با برخی قارچ‌ها (کریپتوکوکوس، هیستوپلاسما و پاراکوکسیدیومایکوزیس) ممکن است با ارگانیسم‌های قارچی غیرزنده در بافت مواجه باشیم و نیز در حالاتی که بیمار تحت درمان با داروهای ضدقارچی است.
ج- تناقض بین نتایج کشت و یافته‌های هیستوپاتولوژیک
1- مرفولوژی کلاسیک قارچ به علت اثر داروهای ضد قارچی یا پاسخ‌های میزبان تغییر کرده است.
2- یک عفونت دوگانه وجود دارد در حالی که فقط یک قارچ در پلیت رشد کرده است.
- با مطالعات بیشتری که به کمک PCR انجام‌شده مشخص شده است که عفونت‌های دوگانه بسیار بیشتر از آنچه تصور می‌شود وجود دارد، بطوریکه حدود 20% عفونت‌ها به‌صورت دوگانه رخ می‌دهند.
- در چنین حالاتی پاتولوژیست فقط به توصیف فراوان‌ترین عنصر قارچی اشاره کرده و مشخصات قارچ دوم ذکر نشده است. در این صورت اگر قارچ دوم رشد کند نتایج بدست‌آمده متناقض به نظر خواهند رسید.
چرا فقط یک قارچ در عفونت‌های دوگانه در کشت جدا می‌شوند؟
1- too aggressive processing موجب می‌شود سلول‌های قارچی بزرگ‌تر نابود شوند، اما سلول‌های کوچک‌تر زنده می‌مانند.
2- رشد یک قارچ مانع رشد قارچ دوم می‌شود.
3- شرایط نامناسب کشت، بطوری که فقط یک قارچ توانائی رشد پیدا می‌کند.
- برای شناسایی عفونت‌های دوگانه می‌توان از تکنیک‌های زیر استفاده کرد:
- Dual-color immunohistochemistry
- In situ hybridization
- Laser microdissection
- Panfungal or specific PCR
References:
- 1- Treated bacterial endocarditis as a histological mimic of fungal infection. J Clin Pathol 1998,51:539-40
- 2- Misdiagnosis Caused by Fungal Contaminant in a Histological Stain Solution. J Clin Microbiol 1980, 174-7
- 3- Diagnostic accuracy of morphologic identification of filamentous fungi in paraffin embedded tissue sections: correlation of histological and culture diagnosis. Indian J of Path & Microbiol. 2014, 57(4):583-7
چگونه نتایج آزمایش‌های قارچ شناسی را گزارش کنیم؟
آزمایشگاه تشخیص پزشکی و قارچ‌شناسی کلینیکی (1)
برای دانلود پی دی اف بر روی لینک زیر کلیک کنید
ورود / ثبت نام