بررسی انواع هاپلوتیپ‌های همراه هموگلوبین دی- پنجاب در مجموعه ژنی بتاگلوبین در ساری

بررسی انواع هاپلوتیپ‌های همراه هموگلوبین دی- پنجاب در مجموعه ژنی بتاگلوبین در ساری

محمدرضا مهدوی¹، حسین جلالی¹، مهرنوش کوثریان¹، حسین کرمی¹، پیام روشن²، فاطمه مداحیان²

نویسنده مسئول: پیام روشن

1. مرکز تحقیقات تالاسمی، دانشگاه علوم پزشکی مازندران
2. گروه پژوهشی سینامهر

آدرس: ساری – بلوار کشاورز – گروه پژوهشی سینامهر

ایمیل: info@fajrlaboratory.com

 

 خلاصه مقاله

چکیده: هموگلوبين دی- پنجاب يکي از انواع هموگلوبينوپاتي‌ها است كه در آن جهش در موقعيت 121 بر روي زنجيره بتا رخ داده است. اين اختلال هموگلوبيني در هندوستان، پاكستان و ايران شايع مي‌باشد. افراد هتروزیگوت برای این بیماری غالباً بدون علامت بالینی خاصی می‌باشند، در حالی که در حالت هتروزیگوت مرکب با هموگلوبین S، افراد مبتلا کم‌خونی داسی شکل را بروز می‌دهند. مطالعه قبلی ما نشان داد که تمامی واریانت‌های هموگلوبین دی در ساری از نوع دی- پنجاب می‌باشند ولی نوع هاپلوتیپ‌های همراه این واریانت شناخته نشده بود. هدف از این مطالعه شناسایی انواع هاپلوتیپ‌های همراه هموگلوبین دی در مجموعه ژنی بتاگلوبین بوده است.

مواد و روش‌ها: در بررسی حاضر تعداد 18 نفر از خانواده‌های افرادی که دارای هموگلوبین دی- پنجاب بوده‌اند انتخاب گردیدند و DNA ژنومی از تمامی افراد با استفاده از روش استاندارد فنل- کلروفرم استخراج گردید. سپس نوع هاپلوتیپ همراه هموگلوبین دی- پنجاب با استفاده از تکنیک PCR-RFLP و آنالیز پیوستگی در خانواده مشخص شد.

نتایج: مطالعه حاضر نشان داد که در 17 خانواده از 18 خانواده بررسی شده آلل هموگلوبین دی با هاپلوتیپ[+ – – – – + +]  پیوستگی دارد و تنها در یک خانواده نیز آلل دارای هموگلوبین دی به همراه هاپلوتیپ [- + + – + + +] دیده شد.

بحث: مطالعه ما نشان داد بخش عمده واریانت هموگلوبین دی- پنجاب در ساری دارای منشأ یگانه می‌باشند و هاپلوتیپ نادر دیده شده احتمالاً یا منشأ ژنتیکی متفاوتی دارد یا در اثر مکانیسم‌هایی از قبیل نوترکیبی ژنی به وجود آمده است.

لغات کلیدی: هموگلوبین دی-پنجاب، هاپلوتیپ، PCR-RFLP، ساری

مقدمه

هموگلوبینوپاتی‌ها از شایع‌ترین بیماری‌های وراثتی در سرتاسر دنیا می‌باشند که در اثر نقص در عملکرد هموگلوبین به وجود می‌آیند. این بیماری‌ها در خاورمیانه و ایران شایع می‌باشند. تاکنون 1536 نقص در ژن گلوبين شناخته شده است که بسياري از آنها با بررسي حرکت الکتروفورتيك بر روي استات سلولز (pH:8.6) و سيترات آگار (pH:6.2) شناسائي مي‌شوند (1). در استان مازندران نیز در حدود 10% از جمعیت ناقل جهش‌های ایجاد کننده بتا تالاسمی و بیش از 15% نیز ناقل جهش‌های ژن آلفا تالاسمی می‌باشند (2). واریانت‌های متفاوتی از هموگلوبین دی از قبیل پنجاب (Punjab)، ايران (Iran)، اگری (Agri)، ايبادان (Ibadan)، بوشمن (Bushman)، اولد رباه Ouled Rabah))، گرانادا (Granada) و نيث (Neath) تاکنون شناسایی شدند که از این تعداد هموگلوبین دی- پنجاب (Punjab) و ايران (Iran) در ایران گزارش شده‌اند. هموگلوبين دی- پنجاب(beta121 (GH4) Glu>Gln)  که با نام‌های لس‌آنجلس، شیکاگو، نورث کارولینا، پرتغال و اوک ریج Oak Ridge نیز شناخته می‌شود داراي شيوع دو درصدي در مناطقي از هند و پاكستان و شيوع يک درصدي در کشورهاي غربي مي‌باشد، همچنين مواردي از آن در اقوام اروپائي و در نژاد سياه نيز گزارش شده است. اين افراد رابطه نزديكي با اقوام هندي كه در گذشته مهاجرت كرده‌اند داشته‌اند (3).

هموگلوبین دی درحالت هتروزیگوت و هموزیگوت همراه با علائم بالینی خاصی نمی‌باشد ولی چنانچه این واریانت از هموگلوبین به صورت هتروزیگوت مرکب با جهش‌های ایجاد کننده بتا تالاسمی و یا با هموگلوبین S وجود داشته باشد، می‌تواند کم‌خونی ملایم تا متوسط در افراد مبتلا ایجاد کند (3).

مطالعات قبلی ما با استفاده از روش PCR-RFLP نشان داد که تمامی افرادی که در استان مازندران حامل واریانت پنجاب هموگلوبین دی بوده‌اند و سایر واریانت‌های این هموگلوبین از قبیل هموگلوبین دی- ایران در استان یافت نشد. با این وجود هاپلوتیپ‌های همراه هموگلوبین دی- پنجاب در استان ناشناخته بوده است. هدف از این مطالعه شناسایی هاپلوتیپ‌های مجموعه ژنی بتاگلوبین که با هموگلوبین دی- پنجاب پیوستگی دارند می‌باشد.

مواد و روش‌ها

در این مطالعه تعداد هجده نفر از هفتاد نفری که حامل واریانت هموگلوبین دی- پنجاب بودند انتخاب گردیدند. سپس از این افراد و پدر و مادر آنان نمونه برداری صورت پذیرفت. تمامی افراد شرکت کننده در طرح رضایت خود را از شرکت در پروژه اعلام نمودند. نمونه‌های خون محیطی این افراد تا زمان استخراج DNA در فریزر منهای 20 درجه سانتیگراد نگهداری شدند.

جهت استخراج DNA از نمونه‌های خون این افراد از روش استاندارد فنل-کلروفرم استفاده گردید. در ابتدا جهت بررسی آنالیز پیوستگی در خانواده وجود موتاسیون هموگلوبین دی در پدر و مادر فرد حامل انجام پذیرفت. برای بررسی وجود هموگلوبین دی- پنجاب در فرد و خانواده در ابتدا با استفاده از پرایمرهای اختصاصی قطعه‌ای به طول 861 نوکلئوتید تکثیر شد. پس از پایان تکثیر، محصولات PCR با آنزیم محدود کننده EcoR1 و به مدت یک شب در دمای 37 درجه سانتیگراد قرار داده شدند و سپس بر روی ژل آگارز 2% قرار داده شده و الکتروفورز شدند. در افراد سالم قطعه 861 نوکلئوتیدی به دو قطعه شکسته می‌شود در حالی که در افراد دارای موتاسیون این قطعه بدون تغییر باقی می‌ماند.

سپس بررسی هاپلوتیپ‌های همراه آلل دارای هموگلوبین دی در خانواده افراد حامل با استفاده از آنالیز پیوستگی در خانواده صورت پذیرفت. جهت بررسی هاپلوتیپ‌های مجموعه ژنی بتاگلوبین در اعضای یک خانواده از روش PCR-RFLP به منظور شناسایی هفت پلی‌مورفیسم در سرتاسر مجموعه ژنی بتاگلوبین استفاده شد. این هفت جایگاه و آنزیم‌های محدودالاثری که آن را برش می‌دهند عبارتند از:

آنزیم های محدودالاثر Hinc II در ژنe ، Hind III در ژن G^γ، Hind III در ژن A^γ ، Hinc II در ژن βψ5’، Hinc II در ژن βψ3’، Ava II در ژن β و Bam H1 در ژن β گلوبین.

برای انجام واکنش PCR از دستگاهMJ mini  (Bio Rad، ساخت آمریکا) استفاده شد. تمامی واکنش‌ها در برنامه یکسانی اجرا شدند که عبارت بود از 10 دقیقه در دمای 94 درجه سانتیگراد، 35 سیکل شامل (45 ثانیه در دمای 94 درجه سانتیگراد، 45 ثانیه در دمای 56 درجه سانتیگراد و 45 ثانیه در دمای 72 درجه سانتیگراد) و در نهایت 5 دقیقه در دمای 72 درجه سانتیگراد.

پس از اطمینان از صحت عملکرد واکنش PCR با استفاده از الکتروفورز ژل آگارز، واکنش هضم آنزیمی برای هر جایگاه به طور جداگانه انجام پذیرفت. حجم نهایی واکنش هضم آنزیمی 15 میکرولیتر بوده است که شامل 5/1 میکرولیتر بافر، 5/0 میکرولیتر آنزیم محدودالاثر و 13 میکرولیتر از محصول PCR بوده است. تمامی نمونه‌ها به مدت یک شب در دمای 37 درجه سانتیگراد انکوبه شدند و در روز بعد بر روی ژل آگارز 2% لود شده و در زیر نور UV آنالیز می‌گردیدند. در صورتی که تمامی محصول PCR به دو قطعه تقسیم می‌شد فرد به عنوان +/+ برای جایگاه تشخیص داده می‌شد. در صورتی که نیمی از محصولات PCR برش می‌خوردند فرد +/- گزارش می‌شد و در صورت عدم برش برای هر جایگاه شخص به صورت -/- در نظر گرفته می‌شد.

با بررسی آنالیز پیوستگی در خانواده وضعیت برش تک تک این جایگاه‌ها که به همراه موتاسیون ایجاد کننده هموگلوبین دی- پنجاب به ارث رسیده‌اند، مشخص شد.

با ردیابی آلل دارای هموگلوبین دی- پنجاب و پلی‌مورفیسم‌های همراه آن که مشترکاً به فرزند منتقل شده‌اند نوع هاپلوتیپ‌های همراه هموگلوبین دی- پنجاب شناسایی شدند. در نهایت درصد پیوستگی هر هاپلوتیپ با هموگلوبین دی محاسبه گردید.

نتایج

در این مطالعه تعداد 18 نفر جهت بررسی خانوادگی برای مشخص شدن نوع هاپلوتیپ همراه هموگلوبین دی- پنجاب انتخاب گردیدند. ژنوتیپ تمامی این افراد برای هفت جایگاه در مجموعه ژنی بتاگلوبین که توسط آنزیم‌های مشخص برش داده می‌شوند در جدول (1) آورده شده است.

جدول (1) ژنوتیپ افراد دارای هموگلوبین دی- پنجاب در هفت جایگاه از مجموعه ژنی بتاگلوبین

 

پس از بررسی تمامی جایگاه‌های ذکر شده با آنزیم‌های مربوطه در والدین افراد مبتلا و آنالیز پیوستگی در تک تک جایگاه‌ها مشخص شد که 17 آلل از 18 آللی که دارای هموگلوبین دی بوده‌اند دارای پیوستگی با هاپلوتیپ[+ – – – – + +]  (جایگاه پلی‌مورفیسم‌ها به ترتیب از چپ به راست می‌باشد) بوده‌اند که به هاپلوتیپ I معروف است. بدین ترتیب پیوستگی آلل همراه هموگلوبین دی با هاپلوتیپ I 94% می‌باشد. آلل دیگر دارای هموگلوبین دی با هاپلوتیپ [- + + – + + +] پیوستگی داشته است.

بحث

هموگلوبین دی- پنجاب به عنوان چهارمین واریته شایع از انواع واریته‌های هموگلوبین در سرتاسر جهان است که در هندوستان، خاورمیانه و کشورهایی که در امتداد جاده باستانی ابریشم واقع شده‌اند دارای بیشترین فراوانی می‌باشد. اگر چه قسمتی از کشور هندوستان که در گذشته مستعمره کشور انگلستان بوده است به عنوان منشأ هموگلوبین دی- پنجاب در سایر کشورها شمرده می‌شد، در مناطقی از دنیا که هیچ ارتباطی با جاده ابریشم و یا کشورهای مستعمره انگلستان نداشته‌اند نیز این واریته از هموگلوبین یافت شده است. تاکنون هموگلوبین دی- پنجاب در بسیاری از کشورهای خاورمیانه مثل ترکیه، عربستان سعودی، امارات عربی متحده و کویت یافت شده است. در ایران نیز در استان‌های جنوبی مثل خوزستان به وفور یافت می‌شود به طوری که 4/1 درصد از جمعیت استان خوزستان حامل هموگلوبین دی می‌باشند که در حدود 50 درصد از این افراد واریته هموگلوبین دی- پنجاب و در 50% دیگر واریته هموگلوبین دی- ایران وجود دارد. مطالعه قبلی ما نیز نشان داد که تمامی افراد دارای هموگلوبین دی در استان مازندران دارای واریته هموگلوبین دی- پنجاب می‌باشند (4، 5 و 6).

وجود واریانت هموگلوبین دی در وضعیت هتروزیگوت با تظاهرات بالینی خاصی همراه نیست. شخص حامل هموگلوبین دی در وضعیت هموزیگوت معمولاً بدون علائم می‌باشد و در مواردی نشانه‌های زیر در وی مشاهده می‌شود: کم‌خونی همولیتیک خفیف، بزرگی خفیف تا متوسط طحال. نوزادان دارای هموگلوبین دی هتروزیگوت/ تالاسمی بتا ممکن است بدون علائم بوده یا کم‌خونی همولیتیک خفیف تا متوسط داشته باشند. این علائم معمولاً در نخستین ماه‌های پس از تولد بروز می‌کند چرا که میزان هموگلوبین F در این زمان کاهش یافته و هموگلوبین دی افزایش می‌یابد. در بیماران هموگلوبین دی / beta⁺ thalassemia کم‌خونی خفیف تا متوسط مشاهده می‌شود و تغییری در طحال ایجاد نمی‌شود. کودکان همــــوگلوبین دی/ beta⁰ thalassemia که فاقد هموگلوبین A می‌باشند، کم‌خونی با علائم و بزرگی طحال را به نمایش می‌گذارند و ممکن است اختلالات بالینی نسبتاً شدید داشته باشند. از آن جا که اندیکس‌های خونی در هموگلوبین دی/ بتا تالاسمی غیرطبیعی است، فقر آهن نیز ممکن است بروز نماید. توارث همزمان هموگلوبین دی به همراه هموگلوبین S منجر به ایجاد کم‌خونی داسی می‌شود که مشابه توارث هموگلوبین E، هموگلوبین C و هموگلوبین O-Arab همراه با هموگلوبین S می‌باشد (3).

در مطالعه‌ای که به منظور شناسایی هاپلوتیپ‌های همراه هموگلوبین دی- پنجاب در غرب ایران صورت پذیرفت رحیمی و همکاران به شناسایی هاپلوتیپ‌های همراه هموگلوبین دی- پنجاب در 22 فرد حامل با استفاده از آنالیز پیوستگی در خانواده این افراد پرداختند. مطالعه ذکر شده نشان داد که آلل دارای هموگلوبین دی- پنجاب در تمامی افراد با هاپلوتیپ [+ – – – – + +] که به عنوان هاپلوتیپ I شناخته می‌شود پیوستگی دارد. بدین ترتیب میزان پیوستگی این آلل با هاپلوتیپ I 100% گزارش شده است. در مطالعه حاضر که در استان مازندران صورت پذیرفت از 18 آلل بررســـی شده 17 آلل به همراه هاپلوتیپ [+ – – – – + +] به ارث رسیده‌اند و پیوستگی آلل دارای هموگلوبین دی با هاپلوتیپ ذکر شده 94% می‌باشد. مطالعه ما نشان می‌دهد که آلل دارای هموگلوبین دی در اکثر افراد حامل در استان مازندران و استان‌های کردنشین ایران احتمالاً منشأ مشترکی داشته‌اند. جالب توجه است که افرادی با هموگلوبین دی- پنجاب در کشورهای مکزیک و ایتالیا، بلژیک و هلند نیز پیدا شده‌اند که دارای هاپلوتیپ مذکور بوده‌اند (7).

با این وجود در مطالعه دیگری که در استان‌های جنوبی ایران (فارس و هرمزگان) توسط یاوریان و همکاران صورت پذیرفت مشخص شد که واریانت هموگلوبین دی- پنجاب در 5/67 درصد از افراد حامل با هاپلوتیپ [+ – – – – + +] پیوستگی دارد درحالی که در 5/17 درصد از موارد با هاپلوتیپ [+ – – – – – +]، در10% از موارد با هاپلوتیپ [– + – – + + +] و در 5% از افراد با هاپلوتیپ [– + – + + + +] پیوستگی داشته است. یاوریان و همکاران الگوی چندگانه منشأ هموگلوبین دی- پنجاب در ایران را مطرح ساختند (3). نتایج مطالعه حاضر به مطالعه رحیمی و همکاران که الگوی یگانه را برای منشأ هموگلوبین دی مطرح می‌سازد نزدیکتر است.

در مطالعه دیگری که در کشور هندوستان و در شرق این کشور صورت پذیرفت هاپلوتیپ‌های مجموعه ژنی بتاگلوبین که به همراه آلل دارای هموگلوبین دی– پنجاب به ارث می‌رسیدند مورد بررسی قرار گرفتند. در بررسی‌های صورت گرفته بر روی 11 خانواده غیر خویشاوند مشخص شد که در 9 خانواده (0/76%) آلل دارای موتاسیون ایجاد کننده هموگلوبین دی– پنجاب به همراه هاپلوتیپ شایع [+ – – – – + +] به ارث می‌رسد و در دو خانواده دیگر (0/24 %) آلل مربوطه با هاپلوتیپ [- – – – – + +] همراه است که برای اولین بار پیوستگی این‌چنینی گزارش شده است. نتایج مطالعه ذکر شده در مقایسه با مطالعه ما نشان می‌دهد که قسمت اعظم افراد دارای هموگلوبین دی- پنجاب در هر دو جمعیت دارای منشأ یکسانی می‌باشند و هاپلوتیپ‌های نادر مشاهده شده همراه هموگلوبین دی- پنجاب در هر دو جمعیت دارای منشأ ژنتیکی متفاوتی می‌باشند (8).

با این وجود در یک فرد مازندرانی به همراه آلل هموگلوبین دی- پنجاب هاپلوتیپ [- + + – + + +] دیده شد که تا کنون در ایران به همراه هموگلوبین دی گزارش نشده است. لازم به ذکر است که این هاپلوتیپ در ترکیه و تایلند به طور جداگانه و به همراه هموگلوبین دی گزارش شده است (9 و 10). این هاپلوتیپ البته به همراه آلل طبیعی در مطالعه رحیمی گزارش شده بود (7).

در کشور ترکیه نیز هاپلوتیپ نادر [- – + – + + +] برای اولین بار در جهان گزارش شد که مانند هاپلوتیپ نادر [- + + – + + +] در استان مازندران می‌توانند منشأ ژنتیکی متفاوت داشته باشند و یا در اثر مکانیسم‌هایی مانند نوآرایی ژنی به وجود آمده باشند (11).

منابع:

1. Marengo-Rowe AJ. Structure-function relations of human hemoglobins. Proc (Bayl Univ Med Cent). 2006;19(3):239-45.

2.  Jalali H, Mahdavi MR, Roshan P, Kosaryan M, Karami H, Mahdavi M. Alpha thalassemia gene mutations in neonates from Mazandaran, Iran, 2012. Hematology. 2013 Sep 12. [Epub ahead of print].

3. Yavarian M, Karimi M, Paran F, Neven C, Harteveld CL, Giordano PC. Multi centric origin of Hb D-Punjab [beta121(GH4)Glu–>Gln, GAA>CAA]. 2009;33(6):399-405.
4. Altay Ç. Abnormal haemoglobins in Turkey. Turk J Haematol. 2002;19(1):63–74.
5. Alotaibi ST, Ahmed MA. Hemoglobin D trait with a thalassemia in a Saudi family. Ann Saudi Med. 2000;20(3–4):251–252.
6. El-Kalla S, Mathews AR. Hb D-Punjab in the United Arab Emirates. Hemoglobin. 1997;21(4): 369–375.
7. Rahimi Z, Akramipour R, Nagel RL, Ahmadi AS, Merat A, Bahrehmand F. The beta-globin gene haplotypes associated with Hb D-Los Angeles [beta121 (GH4)Glu –> Gln] in Western Iran. 2006;30(1):39-44

8.                 Patel DK, Mashon RS, Patel S, Dash PM, Das BS. β-globin gene haplotypes linked with the Hb D-Punjab [β121(GH4)Glu→Gln, GAA>CAA] mutation in eastern India. Hemoglobin. 2010;34(6):530-7.

9. Fucharoen S, Changtrakun Y, Surapot S, Fucharoen G, Sanchaisuriya K. Molecular characterization of Hb D-Punjab [β121(GH4)Glu→Gln] in Thailand. Hemoglobin 2002; 26:261-9.
10. Ozturk O, Atalay A, Koseler A, Ozkan A, Koyuncu H, Bayram J, Demirtepe S, Aksoy K, Atalay EO. Beta globin gene cluster haplotypes of abnormal hemoglobins observed in Turkey. Turk J Hematol 2007; 24:146-54.
11. Hb D-Los Angeles [beta121(GH4)Glu>Gln] and HbBeograd [beta121(GH4)Glu>Val]: Implications fortheir laboratory diagnosis and genetic origins.

برای دانلود پی دی اف برروی لینک زیر کلیک کنید