مروری تازه بر باسیلهای گرم مثبت بدون اسپور
دكتر رضا ميرنژاد (استاد دانشگاه)
لیستریا منوسیتوژنز
لیستریاها داراي گونههاي متعددي هستند كه مهمترين آنها لیستریا منوسیتوژنز[1] است. آنها قبلاً در خانواده كورينهباكتريومها قرار داشتند، ولي امروزه در جنس جداگانه و جزء باسيلهاي گرم مثبت بدون اسپور طبقهبندي ميشوند. باسيل گرم مثبت بهصورت كوكوباسيل، پلیمورفيك بوده و بين 4 تا 40 درجه سلسیوس، اسیدیته پائین و غلظت نمکی بالا رشد ميكند و در 25 درجه سلسیوس متحرك بوده ولي در 37 درجه حركت ندارد. این باکتری دارای یک ویژگی بنام حرکت غلتکی[2] است که در محلول نمکی در دمای اتاق و بهندرت در دمای 35 درجه سلسیوس مشاهده میگردد. این حرکت وابسته به دما همچنین در محیطهای نیمه جامد نیز وجود دارد که در آنها بهصورت چتر در بالای محیط (شرایط هوازی) مشاهده میشود و اکثراً در دماهای پائین دیده میشود و این خصوصیات آن را از دیفتروئیدها که فلور نرمال پوست هستند متمایز میکند. لیستریاها بدون اسپور، کاتالاز مثبت، هوازي و بيهوازي اختياري هستند و بر روي محیطهای بلاد آگار يك هاله باريك هموليز bايجاد ميکنند. وجود Co2 به رشد بهتر ليسترياها كمك ميكند.
لیستریا منوسیتوژنز در خاک، گردوغبار، آب علفهای تازه، فاضلاب، شیر خام غیرپاستوریزه و در ناقلین بدون علامت انسانی (در دستگاه گوارش و مجاری تناسلی زنان) و دامی مشاهده میشود. سرایت ارگانیسم بهوسیله غذاهایی مانند سالاد کلم، شیر غیرپاستوریزه و پنیرهای نرم و از طریق جفت یا تماس به هنگام زایمان صورت میگیرد. اگر زني قبل از حاملگي حامل ليستريا منوسیتوژنز در مجاري گوارشي خود باشد، جنين او در طي حاملگي مبتلا نخواهد شد. در صورتي كه اگر مادري در حين حاملگي مبتلا به ليستريا منوسیتوژنز شود احتمال انتقال آن به جنين داخل رحم يا طي زايمان زياد است. بر اساس اطلاعاتی که از بررسیهای میکروبیولوژی مواد غذایی بدست آمده است، لیستریا منوسیتوزنز در 2 تا 3 درصد محصولات لبنی، 20 درصد پنیرهای نرم و گوشت پروسس نشده، 30 درصد سبزیجات خام (کلم و تربچه) و بیش از 50 درصد گوشت و مرغ نیمپخت وجود دارد. تقریباً 1 تا 10 درصد انسانها ناقلین مدفوعی هستند. بیماری ناشی از این باکتری لیستریوزیس نام دارد که اساساً بیماری کشورهای صنعتی است و به شکل پراکنده یا بهصورت اپیدمیهایی رخ میدهد. شکل اولیه سرایت از طریق محصولات غذایی آلوده است، اگرچه گاهی همهگیریهای غیرمرتبط با مواد غذایی آلوده در مکانهای مراقبتی بهخصوص در سالمندان به دلیل عفونت متقاطع رخ میدهد. روغنهای معدنی آلودهی مورد استفاده در حمامها در این همهگیریها دخالت دارند. یک مطالعه مروری متاآنالیز با بررسی بیش از 1700 مقاله به شکل جهانی نشان داد که در سال 2010، 23150 مورد بیماری و 5463 مورد مرگ ناشی از لیستریوزیس رخ داده است. در این سالها نسبت موارد پریناتال 20/7 درصد بوده است.
در بالغين الگوي ليستريوزيس به سن و وضعيت ايمني فرد بستگي دارد. مسنترها و مبتلايان به ديابت، سرطان، پيوند كليه و نقص در عمل سلولهای T، معمولاً مبتلا به بيماريهاي منتشر ميشوند كه نتيجة آن مننژيت است. کسانی که پيوند كليه انجام دادند و یا دچار لوسميها هستند، ممكن است دچار آبسه مغزي نيز شوند. ليستريوزيس در افراد مسن و اشخاص دارای نقص ايمني با سردرد، استفراغ، تب و درد آغاز ميشود. علائم مننژيت حاد سريعاً ظاهر شده و گاهي سپسيس و اندوكارديت نيز دیده ميشود. باکتریمی اولیه یا عفونتهای کانونی خارج از سیستم عصبی مرکزی (CNS) غیررایج هستند. لیستریوز جلدی اولیه وابسته به شغل بوده و در میان دامپزشکان و کارگران کشتارگاهها پس از تماس با بافت حیوانات آلوده رخ میدهد. اندوکاردیت، استئومیلیت، آرتریت، اندوفتالمیت و دیگر عفونتهای کانونی بندرت گزارش شده است. بیماری تبدار گوارشی به دلیل مصرف مواد غذایی نظیر شیرکاکائو، سالاد مرغ، گوشت و پنیرها رخ میدهد. به افراد با سیستم ایمنی ناکارآمد نظیر افراد دارای لوسمی، پیوند مغز استخوان و بیماران تحت درمان با سرکوبکنندههای سیستم ایمنی، نسبت به مصرف غذاهای غیرپخته گوشتی از جهت آلودگی با این ارگانیسم هشدار داده میشود.
زنان حامله و ساير بالغين سالم كه غذاي آلوده به ليستريا منوسیتوژنز خوردهاند، دچار بيماري خفيف شبيه آنفلوآنزا ميشوند كه علائم آن تب، سردرد، تهوع، درد شكم و گرفتگي كمر است. بيماري خودبهخود در اين بالغين بهبود مييابد، البته زنان حامله ميتوانند عفونت را به جنينشان خصوصاً در 3 ماهه سوم انتقال دهند كه منجر به سقط، زايمان زودرس يا عفونت نوزاد میشود.
نوزاداني كه از طريق جفت آلوده ميشوند دچار ليستريوزيس زودرس[3] (بيماري گرانولوماتوز و پنوموني) ميشوند و آنهايي كه طي تولد و به هنگام مواجهه با مايعات آلوده بدن مادر مبتلا ميشوند دچار ليستريوزيس ديررس[4] (مننژيت) ميگردند. در جدول 1 اين عفونتها با هم مقايسه شدهاند.
جدول 1: مقايسه ليستريوزيس زودرس و ديررس در نوزادان
راه عفونت | علائم و عوارض ظهور كلينيكي | مهمترين نشانههاي كلينيكي | ميزان مرگومیر | درصد مادران مبتلا به ليستريوزیس مشخص | |
زودرس | جفت | 2 روز بعد از تولد | گرانولوماتوز اينفانتي سپتيكا[5] (گرانولوماتوزيس و آبسه منتشر)، سيانوز و پنوموني | 15-50 درصد | 50 درصد |
ديررس |
آلودگي با مايعات در حين تولد | 1-2 هفته بعد از تولد | مننژيت | 10-20 درصد |
5 درصد< |
شایعترین سروتيپهاي ليستريا منوسیتوژنز a2/1،b2/1،b4 است. سروتيپ b4 عامل اپیدمی لیستریوزیس در ارتباط با پنیر تهیه شده از شیر غیرپاستوریزه است. لیستریا ایوانوئی[6] تنها گونه در میان 5 گونه لیستریا است که برای حیوانات بیماریزا است.
مکانیسم بیماریزایی عفونت لیستریوز در سالهای اخیر شناخته شده است. حساسیت میزبان، اسیدیته معده، مقدار تلقیح و ویژگیهای بیماریزایی ارگانیسم در کنار محصولات غذایی خاص شایعترین فاکتورهایی هستند که تعیینکننده پیشرفت عفونت به بیماری و شدت بیماری در افراد دارای عفونت است.
تشخیص آزمایشگاهی:
نمونههای ارسالی به آزمایشگاه جهت تشخیص آزمایشگاهی لیستریا منوسیتوژنز شامل خون، CSF، ادرار، مکونیوم، ضايعات پوست، جفت، ترشحات واژن پس از زایمان، گلوي نوزادان، شیر و سایر مواد غذایی و گوشت است. برای تشخیص آن از روشهای زیر استفاده میگردد:
رنگآمیزی گرم: باسیلهای گرم مثبت، بدون اسپور و با کپسول کوچک، مستقیم یا منحنی به طول 2-0/5 میکرومتر که انتهای آنها گرد است و به شکل منفرد، V، جفتهای موازی یا زنجیره پهلوی یکدیگر قرار میگیرند. ممکن است با استرپتوکوک یا دیفتروئید و در صورت رنگبری زیاد با هموفیلوس اشتباه شود. اگر از محیط مایع لام تهیه شود، باسیلها بلندتر به نظر میآیند. لازم به ذکر است که بعد از 48 ساعت بسیاری از آنها و در کشت کهنه تمام آنها گرم منفی میشوند.
کشت: این باکتری در بیشتر محیطها بهراحتی رشد میکند. با اینکه لیستریا را بهآسانی میتوان از مایع نخاعی و خون جدا کرد، ولی جدا کردن آن از جفت و مدفوع مشکل است و بایستی این نمونهها را مدت دو ماه در یخچال نگهداری کرده و در فواصل زمانی یک هفته پاساژ داد (روش Cold Enrichment). همچنین از آنجایی که بیشتر لیستریاهای منوسیتوژنز داخل سلولی هستند، هر نمونه کلینیکی باید رقیق شود (به نسبت 1 قسمت نمونه به 9 قسمت براث) و در محیط تریپتکاز سوی براث یا تریپتوز براث به مدت 2 ماه در 4 درجه سیلسیوس نگهداری شوند و در این فاصله هر از چند گاهی از نمونه روی محیط جامد برده شود. بهنظر میرسد که سرما سبب افزایش جداسازی لیستریا منوسیتوژنز بهواسطه لیز شدن میزبان که حاوی باکتری است، میگردد.
کلنیهای ایجادشده روی بلاد آگار، صاف، نیمهشفاف و خاکستری بوده و دارای هاله نازکی از همولیز بتا است. اگر در روی محیطهای بیرنگ مانند نوترینت آگار رشد نماید، در مقابل نور مایل (با زاویه 45 درجه) ایجاد رنگ آبی– سبز مینماید. در روی محیط بلاد آگار ممکن است با استرپتوکوک (بهویژه استرپتوکوک گروه B) اشتباه شود که جهت افتراق آن دو میتوان از تست کاتالاز استفاده نمود. لیستریا کاتالاز مثبت و استرپتوکوک کاتالاز منفی است. جدول (1) وجوه افتراق لیستریا از موارد مشابه را نشان میدهد. لازم به ذکر است امروزه از محیط کشت پالکام (PALCAM) پلیمیکسین، آکروفلاوین، کلرید لیتیوم، سفتازیدین، آسکولین و مانیتول) جهت جداسازی لیستریا منوسیتوژنز از نمونههای کلینیکی، غذایی و محیطی استفاده میگردد. از این محیط که یک محیط افتراقی- انتخابی اصلاح شده است میتوان برای افتراق لیستریا از انتروکک و استافیلوکک از روی تخمیر اسکولین و مانیتول استفاده کرد (شکل 1).
شکل (1): نمای کلنی لیستریا منوسیتوژنز روی محیط PALCAM
خصوصیات بیوشیمیایی: لیستریا منوسیتوژنز قدرت تخمیر گلوکز، تریهالوز و سالیسین را دارد و MR و VP مثبت بوده ولی قدرت احیاء نیترات را دارا نیست. این باکتری اورهآز، اندل و H2S منفی است ولی اسکولین و هیپورات سدیم را هیدرولیز میکند. آزمایش کمپ آن با استافیلوکوکوس اورئوس مثبت و با ردوکوکوس منفی است.
خصوصیات ویژه: تحرک لیستریاها مخصوص به خودشان است؛ به این معنی که در لام مرطوب دارای حرکت غلتشی بوده و اگر به مدت 2-1 ساعت در محیط آبگوشت در دمای اتاق (25 درجه سلسیوس) انکوبه شود، این نوع حرکت مشهودتر است. اگر محیط مایع در 37 درجه سلسیوس قرار گیرد حرکت ضعیف میگردد. این باکتری اگر در محیط جامد در شرایط حرارت اتاق کشت داده شود، حرکت باعث ایجاد پدیدهای میشود که از آن به چتر معکوس تعبیر میگردد.
جدول 2: وجوه افتراق لیستریا منوسیتوژنز از باکتریهای مشابه
باکتری | کاتالاز | هیدرولیز اسکولین | حرکت | بتا همولیز | H2S/TSI |
لیستریا منوسیتوژنز | + | + | + | + | – |
گونههای کورینه باکتریوم | + | – | -/+ | -/+ | – |
گونههای پروپیونوباکتریوم | + | +/- | – | -/+ | – |
اریزپیلوتریکس روزیوپاتیه | – | – | – | – | + |
گونههای لاکتوباسیلوس | – | – | – | – | – |
استرپتوکوکوس آگالاکتیه | – | – | – | + | – |
انتروکوکها | – | + | – | -/+ | – |
حساسیت ضدمیکروبی:
ليستريا منوسیتوژنز معمولاً به پنیسیلین، آمپیسیلین، اریترومایسین، کلرامفینکل، تتراسایکلین و جنتامایسین حساس است. ایزولهها معمولاً بهطور متوسط به کینولونها حساس هستند. سفالوسپورینها علیه گونههای لیستریاها مؤثر نیستند، لذا ایزولهها نباید علیه سفالوسپورینها تست شوند، زیرا آنها برخلاف نتایج آزمایشگاهی در شرایط درون بدن غیرمؤثر هستند.
روشهای تعیین حساسیت لیستریا و معیارهای تفسیری آن در CLSI سند M46-A یافت میگردد. مقاومت به ماکرولیدها، کلرامفینکل و تتراسایکلینها در چند ایزوله بالینی مشاهده شده است. آمپیسیلین بهتنهایی یا در ترکیب با آمینوگلیکوزیدها بهطور موفقیتآمیز در درمان عفونتهای ایجادشده با ليستريا منوسیتوژنز استفاده شده است. تریمتوپریم-سولفومتوکسازول را میتوان بهعنوان داروی جایگزین در بیماران دارای حساسیت به پنیسیلین بهکار برد. آنتیبیوتیکهای جدید مانند داپتومایسین، لینزولاید و تایجیسیکلین که بر روی باکتریهای گرم مثبت مؤثر هستند در شرایط آزمایشگاهی روی ليستريا منوسیتوژنز مؤثرند، اما نتایج بالینی اندکی وجود دارد که حاکی از عدم تأثیر آنها در شرایط آزمایشگاهی است.
نکات مهم:
– تحرک، لیستریا را از اریزپیلوتریکس روزیوپاتیه و بیشتر کورینهباکتریومها جدا میکند.
– برخلاف استرپتوکوکها، لیستریا منوسیتوژنز دارای تست آنتون (چكاندن سوسپانسيون باكتري ليستريا در چشم خرگوش که سبب ورم ملتحمه ميشود) مثبت است.
– ليستريا به انواع آنتيبيوتيكها حساس است، ولي نسبت به پليميكسين B مقاوم است.
– در غلظت زياد نمك، (محيط حاوي 10% Nacl ) لیستریا منوسیتوژنز قادر به رشد است، ولي استرپتوکوکهاي گـــــروه B نميتوانند در چنين محيطي رشد نمایند.
– نمونههای مایع مغزی- نخاعی سانتریفوژ شده را میتوان رنگآمیزی نمود و در آن باکتری گرم مثبت را جستجو کرد.
اریزپیلوتریکس روزیوپاتیه
اریزپیلوتریکس روزیوپاتیه[7] باسيل گرم مثبت، اکسیداز و كاتالاز منفي، غيرمتحرك، فاقد اسپور و غير اسيدفاست است. هوازي و بيهوازي اختياري بوده و توليد H2S مينمايد و با رشد در محيط ژلاتين حالتي شبيه برس لولهشور (Pipe-cleaner effect) ايجاد ميكند. از نظر میکروسکوپی آنها بهصورت باسیلهای کوتاه با انتهای گرد هستند که گاهی بهصورت منفرد در زنجیرههای کوتاه یا فیلامنتهای بدون شاخه مشاهده میگردند. گونههای دیگر این جنس اریزپیلوتریکس تونسیلاروم و اریزوپیلوتریکس اینیپیناتا هستند که جدیداً شناسایی شدهاند.
این باکتری در حیوانات و جانوران دریایی شامل مهرهداران و بیمهرگان بیماریزا است. در انسان شایعترین عفونت آن اریزیپلوئید است که بهصورت ضایعه سلولیت در کف دست و انگشتان دیده میشود. این ضایعه با درد، تورم و بثورات پوستی که گسترش آهسته دارند و بهصورت یک ناحیه بنفش اطراف ضایعه دیده میشوند، همراه است. تورم و قرمزی به اطراف گسترش یافته و زخمها بدون پوستهریزی بهبود مییابند. بیماری سیستمیک نادر است، ولی موارد زیادی از سپتیسمی و اندوکاردیت گزارش میشود. همچنین بهندرت مواردی از آرتریت و آبسههای مغزی نیز گزارش شدهاند. این بیماری یک بیماری شغلی است که در قصابها، کارگران کشتارگاهها، ماهیگیران، پرورشدهندگان ماهی و مشاغلی که به نحوی با حیوانات سروکار دارند، دیده میشود. همچنین این باکتری در انسان شکل منتشر پوستی و باکتریمی همراه با اندوکاردیت را سبب میشود. اریزپیلوتریکس روزیوپاتیه در آب و خاک و ضایعات حیوانی وجود دارد و از طریق تماس بهصورت مستقیم به انسان منتقل میشود. این باکتری در حیوانات اهلی و وحشی، پرندگان، ماهیها و مواد آلی فاسد گسترش دارد و سبب عفونت در خوک، گوسفند، خرگوش، گاو و پرندگان و ماکیان میشود. اریزپیلوتریکس تونسیلاروم نیز از نمونههای انسانی جدا شده است. فاکتورهای بیماریزایی شامل هیالورنیداز، نورامینیداز و کپسول ناپایدار در مقابل حرارت هستند.
تشخیص آزمایشگاهی:
نمونه ارسالی به آزمایشگاه جهت تشخیص آزمایشگاهی اریزپیلوتریکس روزیوپاتیه، خون (در موارد اندوکاردیت و باکتریمی)، بیوپسی پوست، تزریق سرم فیزیولوژی به حاشیه زخم و آسپیره کردن مجدد آن است. به دلیل اینکه ارگانیسمها در لایههای زیرجلدی لبههای زخم قرار گرفتهاند، لذا سوابهای سطحی برای کشت مناسب نیستند. برای تشخیص آن از روشهای زیر استفاده میشود:
آزمایش مستقیم: در نمونههای انسانی فاقد ارزش تشخیصی است و در زیر لام شبیه به لیستریا منوسیتوژنز است، ولی بیحرکت و یکنواخت رنگ میشود.
کشت: نمونه بیوپسی یا آسپیره را در محیط آبگوشت حاوی 1% گلوکز به مدت 24 ساعت در 37-35 درجه سلسیوس و شرایط بیهوازی یا در حضور CO2 نگهداری و انکوبه میکنیم.
کشت در آبگوشت، بعد از 24 ساعت کدورت کمی ایجاد میکند. سپس از این محیط به محیط بلاد آگار، شکلات آگار یا ژلوز آسیتدار یا سرمدار پاساژ داده و در مجاورت CO2 به مدت 24 ساعت انکوبه نمایید. لازم به ذکر است که بسیاری از ایزولهها نیازمند حدود 7 روز انکوباسیون برای رشد هستند. کلنیهای حاصل بسیار ریز بوده و حداکثر نیم میلیمتر میباشند. نوع دیگری از کلنیها که خشن هستند اندازه بزرگتری دارند.
اریزپیلوتریکس روزیوپاتیه همولیتیک در نظر گرفته میشود، اگرچه بیرنگشدگی سبزرنگی در ناحیه زیر کلنی 2 روز بعد از انکوباسیون مشاهده شده و از این جهت همولیز آلفا در نظر گرفته میشود. در کشت ممکن است چند کلنی بهطور همزمان ایجاد نماید که مخلوط بودن کشت را تداعی میکند. باسیلهای کلنی، خشن، بزرگتر و بهصورت رشتههای طویل و دراز هستند و احتمال گرم منفی شدن آنها در رنگآمیزی گرم بیشتر است.
بر روی ژلاتین، بیشتر نمونهها در مدت کمتر از 48 ساعت، بهصورت شعاعی رشد نموده و شکل برس لولهشور را پیدا میکنند. همچنین روی تلوریت پتاسیم پس از 24 ساعت مانند نوک سوزن و خاکستریرنگ دیده میشوند که با گذشت زمان بزرگتر و سیاهرنگ میگردند.
اریزپیلوتریکس را باید از لیستریا، لاکتوباسیل و گونههای کورینه باکتریوم بر اساس همولیز، تحرک و تولید کاتالاز افتراق داد. تولید H2S در محیط TSI یا KIA به همراه باکتری گرم مثبت تقریباً همیشه اریزپیلوتریکس را تداعی مینماید (لازم به ذکر است که بعضی استرپتوکوکها و باسیلوسها هم H2S مثبت هستند).
خصوصیات بیوشیمیایی: اریزپیلوتریکس روزیوپاتیه کاتالاز و اکسیداز منفی، اندل، نیترات، VP، ژلاتین منفی است و در محیط TSI ایجاد اسید در سطح و عمق میکند (گاز تولید نمیشود) و H2S کمی در محیط ایجاد مینماید.
حساسیت ضدمیکروبی:
اریزپیلوتریکس به پنیسیلینها، سفالوسپورینها، ایمیپنم، اریترومایسین، کلیندامایسین، کلرامفینکل، تتراسایکلینها و فلورکینولونها حساس بوده اما به سولفونامیدها، آمینوگلیکوزیدها و وانکوماسین مقاوم است. پنیسیلین درمان انتخابی برای عفونتهای سطحی و سیستمیک است. روشهایی که برای انجام تستهای تعیین حساسیت اریزپیلوتریکس روزیوپاتیه انجام میشود و معیار تفسیری آن را میتوان در CLSI سند M45-M2 (CLSI 2010) یافت. پیشگیری از عفونتهای انسانی از طریق کنترل بیماریهای حیوانی با پرورش صحیح و مدیریت گلهها، بهداشت خوب و فرایندهای ایمنسازی انجام میشود.
لاکتوباسیلوسها
این باسیلها معمولاً غیرپاتوژن و فلور طبیعی دهان، روده و واژن بوده و بندرت ممکن است در پوسیدگی دندان، اندوکاردیت، باکتریمی، عفونت ادراری، مننژیت و پنومونی همراه با آمپییم نقش داشته باشند. احتمال دارد این باکتری با دیفتروئید اشتباه شود. آنها بیهوازی اختیاری یا مطلق، گرم مثبت به شکل مستقیم یا خمیده هستند و بهطور منفرد یا زنجیره بدنبال یکدیگر قرار میگیرند و پلیمورفیسم زیادی دارند. بدون حرکت، اسپور و کپسول میباشند و کاتالاز منفی هستند. آنها روی بلاد آگار بهسختی رشد میکنند. یکی از خصوصیات قابلتوجه آنها ایجاد زنجیره است که در تشخیص میتواند کمککننده باشد. وجود تعداد قابلتوجه لاکتوباسیل در اسمیر واژن نشاندهنده حالت طبیعی و فقدان عفونت است.
شکل کلنی آن روی محیط بلادآگار بسیار متغیر بوده، از کلنیهای ریز آلفا همولیتیک شبیه استرپتوکوک تا کلنیهای بزرگ، خشن و خاکستری را شامل میشود. جهت تشخیص آن از استرپتوکوک، آن را در محیط تیوگلیکولات کشت میدهیم که منجر به ایجاد زنجیرههای باسیلی میگردد.
[1] – Listeria monocytogensis
[2] – Tumbling
[3] – Early-onset listeriosis
[4] – Late –onset listeriosis
[5] -Granulomatosis infantiseptica
[6] – Listeria ivanovii
[7] Erysipelothrix rhusiopathia
مروری تازه بر باسیلهای گرم مثبت اسپوردار
برای دانلود پی دی اف برروی لینک زیر کلیک کنید
ورود / ثبت نام