اسپکتروفتومتری
تهیه کننده: محمدرضا یزدانی، کارشناسی ارشد ایمنی‌شناسی، دانشگاه علوم پزشکی شیراز
کلیات:
اکثر آزمایش‌هایی که در آزمایشگاه شیمی بالینی انجام می‌شوند برمبنای اندازه‌گیری میزان نور جذب‌شده توسط ترکیب موردنظر می‌باشد. این میزان به‌وسیله دستگاه اسپکتروفتومتر اندازه‌گیری می‌شود. معمولاً اندازه‌گیری‌ها در طیف نور مرئی (Visible Range) صورت می‌گیرد. با استفاده از قانون Beer که غلظت یک ترکیب مستقیماً بستگی به میزان نور جذب‌شده یا به‌طور معکوس بستگی به نور بازتاب (Transmittance) دارد، غلظت این مواد را می‌توان محاسبه نمود.
قسمت‌های مختلف اسپکتروفتومتر معمولی:
منبع نوری: برحسب تابش نور با طول‌موج مناسب به درون محلول موردنظر، منبع نوری انتخاب می‌گردد. لامپ تنگستن منبع قابل‌استفاده‌ای برای تهیه طیف کامل نور می‌شود، البته لامپ تنگستن هالوژنه (Tungsten iodide) هم برای نور مرئی و هم UV به کار می‌رود. از لامپ هیدروژنی و دیوتریوم برای اندازه‌گیری در طیف ماوراء بنفش استفاده می‌کنند. در انتخاب اسپکتروفتومتر باید توجه نمود که در چه آزمایش‌هایی کاربرد دارد، به‌طور مثال لامپ هیدروژنی برای آزمایش‌هایی که طول‌موج لازم برای آن‌ها بالای 340nm باشد ضعیف و غیرقابل استفاده است.
شیار ورودی (Entrance Slit): کار آن متمرکز کردن شعاع‌های نوری جداشده از ورود نور پراکنده (Stray light) به درون سیستم منوکروماتور است.
منوکروماتور (Mono chromator): سیستمی که نور با طول‌موج مشخص را جدا و انتخاب می‌کند. مونوکروماتور وسیله‌ای است که طیف طول‌موج نور را با استفاده از منشور یا Grating جدا می‌کند (در فتومترها معمولاً از فیلتر تداخلی استفاده می‌شود).
منشور: یک شیشه با لبه‌های تیز و به شکل هرم می‌باشد که به علت تفاوت در ضریب شکست بر اساس طول‌موج نور، نور سفید وارد شده به درجات مختلف پخش می‌شود. بر اساس طول‌موج نور، نور قرمز کمتر از ناحیه آبی یا بنفش طیف شکسته می‌شود. هر چه طول‌موج کمتر باشد شکست آن بیشتر است.
Grating: وسیله‌ای است به‌صورت یک صفحه که دارای 3000 یا بیشتر شیار کوچک می‌باشد. هر شیار مانند یک منشور عمل می‌کند و یک طیف رنگی ایجاد می‌کند. طیف‌های هم‌فاز یکدیگر را تقویت می‌کنند و شدت نور بیشتری دارند.
محدوده طول‌موج (Spectra band width) SBW: به غیر از نور لیزر، بقیه نورها به‌صورت واقعی مونوکروم نیستند؛ یعنی فقط یک طول‌موج نبوده و متشکل از طیفی از طول‌موج‌ها می‌باشند. میزان مونوکروماتیک بودن را با اصطلاحات زیر تعریف می‌کنند:
Spectral Band Width (SBW): عبارتست از طیفی از طول‌موج که از شیار خروجی سیستم Wavelength Selector می‌گذرد.
طول‌موج اسمی (Nominal): این شعاع نور، طول‌موجی است که در آن ماکزیمم شدت نور وجود دارد و طول‌موج اسمی در مرکز کل طیف خارج‌شده قرار می‌گیرد.
برای فیلتر فتومتر، طول‌موج اسمی، طول‌موج ذکرشده بر روی فیلتر است و برای اسپکتروفتومتر طول‌موج اسمی، طول‌موجی است که بر روی دستگاه انتخاب می‌شود، مثلاً در اسپکتروفتومتر با SBW 20 نانومتردر صــــورت انتخاب طول‌موج 540nm طیف نوری تولیدشده بین 550-530 نانومتر خواهد بود، ولی ماکزیمم شدت تابش در طول‌موج 540 می‌باشد. SBW نشانه مرغوبیت یک مونوکروماتور است، مثلاً Grating از نوع مرغوب دارای SBW برابر با 5 نانومترمی‌باشد. هر چه SBW یک مونوکروماتور کمتر باشد، شدت نور ایجادشده و تعداد جذب نوری بیشتر است. برای جذب نوری در طول‌موج خاص به میزان 0.99% باید SBW کمتر از 10nm باشد.
هر ماده شیمیایی دارای طیف جذب نوری خاصی است. برای اندازه‌گیری هر ماده شیمیایی باید از اسپکتروفتومتری استفاده کرد که SBW آن 0/1طیف جذبی ماده موردنظر (NBW=Natural Band Width ) باشد.
شیار خارجی (Exit Slit): کار آن متمرکز کردن شعاع‌های نوری جداشده بر روی کووت است.
کووت: وظیفه کووت نگه داشتن محلول در دستگاه است تا جذب نوری آن اندازه‌گیری شود. کووت‌ها از جنس Soft glass، بروسلیکات، کوارتز و پلاستیک می‌باشند. کووت‌های شیشه‌ای مخصوص بــــــرای طول‌موج 950- 320 nm مناسب هستند. از کووت کوارتز برای طول‌موج کمتر از 320nm استفاده می‌شود. کووت‌ها در سطوح مقطع دایره‌ای و مربع موجود می‌باشند. کووت‌های مربع از جذب بیشتری برخوردارند.
دتکتور: کار آن تبدیل انرژی نوری به الکتریکی است.
عقربه کالوانومتر: کار آن نشان دادن مقدار جذب یا عبور نور است.
توصیه‌های کلی:
همیشه نیم ساعت قبل از خواندن تست‌ها، اسپکتروفتومتر را روشن کنید.
از یک پایدارکننده ولتاژ در مسیر برق و اسپکتروفتومتر استفاده کنید.
نظافت و تمیز کردن اسپکتروفتومتر الزامی است؛ سالی دوبار بدنه‌ی اسپکتروفتومتر را باز کرده و گرد و غبار موجود را تمیز نمایید. روغن‌کاری چرخ‌دنده‌ها در فواصل سه‌ماهه ضروری است. لامپ اسپکتروفتومتر را با Lens paper ماهی یک بار تمیز نمایید. مسیر کووت‌ها و شیارها را در فواصل هفتگی تمیز نمایید.
در موقع عدم استفاده از اسپکتروفتومتر، حتماً روکش آن را بکشید.
اسپکتروفتومتر را از جای خود حرکت ندهید. به آن ضربه وارد نشود.
حداقل خطای نسبی T% در 36.8% و جذب (Absorbance) در 0.439 می‌باشد. درصورتی‌که جذب نوری محلول بیشتر از 0.7 باشد یا T کمتر از 20%، محلول موردنظر را رقیق کنید تا جذب نوری در محدوده 0.7-0.1 قرار گیرد.
درصورتی‌که جذب محلول کمتر از 0.1 یا T بیشتر از 80% باشد، خطای زیادی حاصل می‌شود، لذا توصیه می‌شود حجم نمونه را برحسب نیاز 2 تا 3 برابر بردارید تا جذب در محدوده (0.7-0.1) قرار گیرد و ضریب مربوطه را در محاســـــــبه دخالت دهید. بهترین محدوده برای خواندن جذب OD= 0.1-0.7 و برای تی 10-20% می‌باشد.
حجم محلول در کووت باید بالاتر از قسمتی باشد که نور از آن عبور می‌کند. اگر حجم محلول نهایی کم است، مقدار نمونه و راژنت را دو برابر کنید.
شستشوی متناوب کووت با محلول‌های سود، پتاس و اسید کلریدریک رقیق، وایتکس( 1 به 10 رقیق شده ) اسید سولفوکرومیک و غیره توصیه می‌شود. کووت را به همراه سایر لوله‌ها نشویید چون ممکن است خش‌دار شوند.
هرگز کووت را با دست لمس نکنید.
کووت باید به‌آرامی در محل خاص خود قرار گیرد و محلول درون آن فاقد حباب باشد. ضمناً باید در خوانش طولانی درب کووت بسته شود تا تبخیر صورت نگیرد.
اسپکتروفتومتر پس از تحویل، مطابق دستور کار بروشور و توسط کارشناس مربوطه، نصب و راه‌انداری شود. به نظافت و کنترل کیفی دستگاه توجه کنید. لیست اقدامات انجام شده ضبط و نگهداری شوند.
کنترل کیفی اسپکتروفتومتر
تست‌های زیادی جهت کنترل کیفی اسپکتروفتومتر وجود دارد که شامل موارد زیر می‌باشد:
صحت طول‌موج
خطی بودن
صحت فتومتریک
کنترل تعویض لامپ
رانش فتومتری
کدورت محلول‌ها
طیف ناخواسته
یکسانی کووت‌ها
کنترل SBW
برای اطمینان از صحت طول‌موج جداشده روش‌های زیر متداول است:
راه چشمی: هر طول‌موج نور دارای رنگ خاصی است. برای کنترل، طول‌موج اسپکتروفتومتر را بر روی طول‌موج موردنظر تنظیم کرده و رنگ نور را با قرار دادن یک مقوای سفید در جلو شیار خارجی مشاهده می‌کنیم، مثلاً در 585 نانومتر رنگ باید زرد باشد. صحت کالیبراسیون طول‌موج در آزمایشگاه‌های آنزیمی اهمیت زیادی دارد.
جایگزینی منبع نوری: صحیح‌ترین راه بررسی صحت طول‌موج، جایگزینی منبع نوری معمولی اسپکتروفتومتر با منبع نوری دیگری است که دارای ماکزیمم تابش نوری در طول‌موج مشخص باشد، مثلاً لامپ دوتریرم دارای خطوط تابشی ناپیوسته در طول‌موج 486nm و 656nm است.
استفاده از فیلترهای شیشه‌ای نظیر Holmium oxide و Didymium.: این فیلترها دارای پیک‌های جذبی مشخصی در طول‌موج‌های خاصی می‌باشند. فیلتر دیدیمیوم در 530 و 585nm حداقل T% را دارد. دستگاه را روشن می‌کنیم و طول‌موج را روی 530 تنظیم می‌کنیم. فیلتر دیدیمیوم را در محفظه کووت قرار می‌دهیم. T را بین 60-50% تنظیم می‌کنیم. طول‌موج را روی 520 تنظیم می‌کنیم و به‌آرامی طول‌موج را به سمت 540nm زیاد می‌کنیم. هر کجا کمترین درصد T را مشاهـــــده کردیم، طول‌موج را یادداشت می‌کنیم. حداقل T باید در محدوده 1±530 به دست آید؛ اگر این‌طور نشد باید طول‌موج تنظیم شود؛ به‌این‌ترتیب که پیچ تنظیم طول‌موج، اگر 1nm کمتر باشد (529nm) برخلاف جهت حرکت عقربه‌های ساعت به تعداد 8 کلیک می‌چرخانیم. برای هر ,nm8 کلیک می‌چرخانیم و از فیلتر Holmium oxide برای اسپکتروفتومترهای با SBW کمتر از nm8 استفاده می‌کنیم؛ به عبارت دیگر:
Narrow SBW → Holmium filter
Broad SBW → Didymium filter
d) محلول رنگی:
محلول دی کرومات پتاسیم (50میلی گرم دی کرومات پتاسیم در یک لیتر اسید سولفوریک 0/01 نرمال حل گردیده) باید دارای ماکزیمم جذب نوری در 257 و 350 نانومتر باشد.
محلول پارانیتروفنل (0.04mmol/litدر سود 0.01نرمال) باید دارای ماکزیمم جذب نوری در 401 نانومتر باشد.
محلول سولفات آمونیوم کبالت(0.0735 mmol/litدراسید سولفوریک 0.18M) باید دارای ماکزیمم جذب نوری در512 نانومتر باشد.
محلول سیان‌مت هموگلوبین (20 ميكروليتر خون و 5 ميلي ليتر درابكين ) . میزان جذب نوری این محلول را در طول‌موج‌های متفاوت اندازه می‌گیریم. از 490 نانومتر شروع کرده و هر 5 نانومتر (با بلانک درابکین) می‌خوانیم. باید ماکزیمم جذب نوری در 540 نانومتر باشد.
کنترل طول‌موج اسپکتروفتومتر باید در فواصل هفتگی و پس از هر تغییر یا تعمیر دستگاه صورت پذیرد.
خطی بودن (Linearity): عبارتست از قدرت اسپکتروفتومتر برای ثبت یک سیگنال به‌صورت متناسب با مقدار نور. خطی بودن به روش‌های زیر مورد آزمایش قرار می‌گیرد:
محلول رنگی
شامل:
پارانیترو فنل در 405 نانومتر
سولفات آمونیوم کبالت در 512 نانومتر
سولفات مس در 650 نانومتر
سیان‌مت هموگلوبین در 540 نانومتر
محلول دی کرومات پتاسیم
بررسي خطي بودن با استفاده از محلول در طول موجهاي مختلف :
براي بررسي خطي بودن در طول موج 540 نانومتر از محلول HiCN ، در طول موج 405 نانومتر از محلول پارانيتروفنل 0/08 ميلي مول در ليتر و در طول موج 340 نانومتر از محلول دي‌كرومات پتاسيم استفاده مي گردد.
جهت بررسي خطي بودن طول موج 540 نانومتر ، مي بايست با مخلوط نمودن خون با درابکين ، ذخيره اي (Stock) از محلول سيان مت هموگلوبين با جذب نوري حدود 2 تهيه شود .( بطور مثال از اضافه کردن 100 ميكروليتر خون با هموگلوبينg/l 170 به 5 ميلي ليتر درابكين ، محلولي با جذب نوري حدود 2/09 بدست مي آيد .) اگر ميزان هموگلوبين نمونه كم باشدحجم بيشتري از خون ، مي بايست به درابكين اضافه شود. سپس از اين محلول ذخيره ، حداقل 4 رقت تهيه مي شود (بطور مثال 1/2 ، 1/4، 1/8 و 1/16) و جذب نوري محلول ذخيره و رقتهاي تهيه شده‌در طول موج ياد شده در مقابل بلانک درابکين، قرائت ميگردد تا 5 خوانده بدست آيد . جذبهاي نوري قرائت شده به عنوان مقدار مشاهده شده (Observed) در نظر گرفته مي‌شود .
براي محاسبه ميزان خطا در هر رقت ،جذب نوري(OD) رقتي از محلول که در حدود 0/4 باشد به عنوان مبنا انتخاب و ميزان خطاي ساير رقتها با توجه به آن محاسبه مي شود تا جذب مورد انتظار بدست بيايد .
بطور مثال اگر جذب نوري نمونه با رقت 1/4 ، حدود 0/4باشد .جذب نوري مورد انتظار براي رقت 1/2 بصورت زير محاسبه مي شود :
| جذب نوری | رقت |
| 0/4 | 1/4 |
| x | 1/2 |
مقدار X بدست آمده ، مقدار مورد انتظار (Expected ) جذب نوري نمونه در رقت 1/2 مي باشد. بدين ترتيب پس از محاسبه جذب نوري مورد انتظار براي رقتهاي مختلف ، ميزان عدم صحت هر رقت با استفاده از فرمول Bias تعيين ميگردد .
مثال زير ، ميزان عدم صحت جذب نوري رقتهاي مختلف نمونه سيان مت هموگلوبين در يک دستگاه فتومتررا نشان مي دهد
| %Bias | (OD observed)
جذب نوري بدست آمده |
(OD expected) جذب مورد انتظار |
| 0.91 | 2.094 | 2.075 |
| 0.18 | 1.663 | 1.66 |
| 1.12 | 1.259 | 1.245 |
| 1.97 | 1.017 | 1.037 |
| 0.48 | 0.826 | 0.83 |
| – | 0.415 | – |
| 2.1 | 0.212 | 0.207 |
براي بررسي خطي بودن در طول موج 405 نانومتر از محلول پارانيتروفنل 0/08 ميلي مول در ليتر استفاده ميگردد .
طرز تهيه اين محلول:
وزن يک مول پارانيتروفنل = 139/11 گرم
يک ميلي مول =0/13911 گرم
براي تهيه پارانيتروفنل 0/08 ميلي مول در ليتر ، با استفاده از محاسبه زير ، مي بايست 11/11288 پارانيتروفنل ( بطور تقريبي 11/1 ميلي گرم) در يک ليتر هيدروکسيد سديم (Na OH) 0/01 نرمال حل شود.
0.13911 × 0.08 = 0.0111288 = گرم 11.11288 ميلي‌گرم ~ 11.1 ميلي‌گرم
اين محلول جذبي در حدود 2 خواهد داشت و با تهيه رقتهاي مختلف در سود(Na OH)0/01 نرمال مي‌توان خطي بودن در محدوده جذب 0.1 تا 2 را در طول موج 405 نانومتر و در مقابل بلانک سود، بررسي نمود.بطور مثال با تهيه محلولهايي با غلظت 0.06 ، 0.04 ، 0.02 ، 0.01 و 0.005 ميلي مول در ليتر نتايج زير بدست آمده و Bias محاسبه گرديده است.
| جذب نوري | غلظت |
| 0.463 | 0.02 |
| x | 0.04 |
همانطور که قبلا گفته شد جذب نوري حدود 0.4 را ملاک قرار داده و با تناسب مانند مثال زير جذب نوري مورد انتظار هر غلظت را محاسبه نماييد.
| Bias % | جذب نوري بدست آمده | جذب نوري مورد انتظار | غلظت محلول پارانيتروفنل µmol/L |
| 3 | 1.908 | 1.852 | 0.08 |
| 2 | 1.418 | 1.389 | 0.06 |
| 1.2 | 0.937 | 0.926 | 0.04 |
| – | 0.463 | – | 0.02 |
| 2.6 | 0.225 | 0.231 | 0.01 |
| 2.6 | 0.113 | 0.116 | 0.005 |
براي بررسي خطي بودن درطول موج 340نانومتر از محلول دي‌کرومات پتاسيم استفاده مي‌شود.
برای تهيه محلول، پودر دي‌کرومات پتاسيم را در oven با حرارت 110 درجه سانتي‌گراد به مدت يکساعت خشک کرده و 200 ميلي‌گرم آن را با اسيد سولفوريک 0/01 نرمال به حجم 1 ليتر برسانيد. اين محلول را بعنوان ذخيره در شيشه تيره نگهداري نمائيد. محلول ذخيره جذبي در حدود 2 خواهد داشت و با تهيه رقتهاي مختلف در اسيد سولفوريک 0/01 نرمال، مي‌توان خطي بودن در محدوده جذب 0.1 تا 2 را در مقابل بلانک اسيد سولفوريک، درطول موج 340 نانومتر بررسي نمود. بطور مثال با تهيه محلولهايي با غلظت 200 ، 150 ، 100 ، 50 ، 25 و 10 ميلي گرم در ليتر نتايج زير بدست آمده و Bias محاسبه گرديده است.
| جذب نوري | غلظت |
| 0.493 | 50 |
| x | 25 |
مشابه مثال قبل جذب نوري حدود 0.4 را ملاک قرار داده و با تناسب مانند مثال زير جذب نوري مورد انتظار هر غلظت را محاسبه نماييد.
| Bias % | جذب نوري بدست آمده | جذب نوري مورد انتظار | غلظت محلول دي‌کرومات پتاسيم mg/L |
| 1.8 | 2.007 | 1.972 | 200 |
| 0.5 | 1.486 | 1.479 | 150 |
| 0.5 | 0.991 | 0.986 | 100 |
| – | 0.493 | – | 50 |
| 0.8 | 0.245 | 0.247 | 25 |
| 4 | 0.095 | 0.099 | 10 |
ميزان عدم صحت مجاز در هر رقت حداکثر 5% پيشنهاد مي‌شود . ولي بهتر است اين مقدار را براساس دستورالعمل سازنده تعيين نمود.
در صورت امکان، استفاده از فيلترهاي شيشه‌اي solid glass filter مانند ديدميوم، جايگزيني براي روش قبل ميباشد.
Didymium Filter در 550 nm: جذب را در طول‌موج 550 نانومتر با هوا صفر می‌کنیم، بعداً جذب فیلتر دیدیمیوم را اندازه می‌گیریم. به همین ترتیب جذب را با هوا روی 0.25 تنظیم می‌کنیم و فیلتر دیدیمیوم را گذاشته و جذب را می‌خوانیم. سپس جذب را با هوا روی0.50 تنظیم کرده و فیلتر دیدیمیوم را گذاشته و جذب را می‌خوانیم. درصورتی‌که اسپکتروفتومتر خطی باشد، باید تفاوت جذب‌ها در مراحل متوالی با فیلتر دیدیمیوم مساوی باشد. خطی بودن اسپکتروفتومتر باید در فواصل هفتگی و پس از هر تغییر و تعمیر دستگاه بررسی شود
| 0.75 | 0.50 | 0.25 | 0 | جذب در 550 nm |
| 0.846 | 0.596 | 0.346 | 0.096 | جذب فیلتر دیدیمیوم |
صحت فتومتریک: هدف از صحت فتومتریک این است که آیا حداکثر جذب نوری به تعداد مشخص در طول‌موج خاصی صورت می‌گیرد یا خیر
برای این کنترل، مقدار جذب نوری محلولی با غلظت مشخص در طول‌موج خاصی تعیین می‌شود. محلول‌های متفاوتی برای این کار مورداستفاده قرار می‌گیرند:
الف) محلول دی کرومات پتاسیم (K2Cr2O7) : حدود 50 ميلي گرم از دي كرومات پتاسيم را به مدت يكساعت در درجه حرارت 110 درجه سانتي گراد قرارداده تا خوب خشك شود. سپس با ترازوي كاليبره، دقيقاً 50 ميلي گرم از ماده فوق برداشته و در يك ليتر اسيد سولفوريك 0/01 نرمال حل ميگردد . سپس اسپكتروفوتومتر توسط بلانك اسيد سولفوريك 0/01 نرمال در طول موج350 نانومتر صفر شده و جذب نوري محلول دي كرومات پتاسيم در اسيد سولفوريك قرائت ميگردد . جذب نوري در محدوده 005 /0 ±0/536 نشاندهنده صحت فتومتريك دستگاه ميباشد.چون NBW محلول دی کرومات 63nm است باید برای خوانش از اسپکتروفتومتری استفاده شود که SBW آن 6nm یا کمتر باشد.
ب) محلول سولفات آمونیوم کبالت (CoSo4[NH44] So4, 6H2O): 14.481 گرم از این ماده در 10 ml اسید سولفوریک غلیظ حل شده و با آب مقطر به حجم یک لیتر رسانده می‌شود. جذب نوری این محلول در طول‌موج‌های مختلف عبارتست از:
| جذب نوری | طول‌موج |
| 0.012 | 400 nm |
| 0.077 | 450 nm |
| 0.163 | 500 nm |
| 0.077 | 550 nm |
توصیه می‌شود صحت فتومتریک به‌صورت ماهانه کنترل شود. اگر صحت فتومتریک کنترل شد و در محدوده قابل‌قبول بود، یعنی همه قسمت‌های اسپکتروفتومتر تنظیم است.
کنترل تعویض لامپ: لامپ‌ها به‌صورت آرام و پیوسته در معرض فرسودگی قرار دارند، در نتیجه باید در فواصل زمانی مرتب آن‌ها را کنترل و بررسی کرد. بعد از نصب لامپ جدید باید سیستم نوری دستگاه تنظیم شود تا حداکثر میزان نور پس از عبور کووت به فتوسل برسد.
روش کنترل با استفاده از آب مقطر
یک کووت پر از آب مقطر در دستگاه قرار دهید و طول‌موج مناسب (550 نانومتر) را انتخاب کنید.
عقربه گالوانومتر در وسط صفحه تنظیم شود.
لامپ و دیگر اجزاء نوری به‌نوبت، کمی تغییر داده شوند و اثر آن‌ها بر روی T یا A بررسی شود.
محلی که حداکثر T به دست آید بهترین موقعیت هر یک از اجزاء سیستم نوری است.
رانش فتومتری (Drift): یک منبع اصلی خطا در اسپکتروفتومتری، عدم پایداری کمیت اندازه‌گیری شده (A یا T) نسبت به زمان یا Drift می‌باشد. این رانش ممکن است به علت فرسودگی شدید منبع نور باشد. ازآنجاکه مقیاس جذب نور لگاریتمی است، رانش عقربه از صفر در طول زمان موجب خطا در تعیین غلظت می‌شود، بنابراین باید پس از خواندن هر 10-5 تست، رانش را کنترل کرده و دستگاه را مجدداً صفر کنید. صفر را با کووت خالی یا کووت محتوی آب مقطر یا محلول بلانک تنظیم کنید. اگر اسپکتروفتومتر به مدت طولانی روشن باشد، دستگاه گرم شده و عملکرد اولیه آن از دست می‌رود و Drift ایجاد می‌شود. درانجام تست‌هایی که از فاکتور استفاده می‌شود، اگر دستگاه Drift داشته باشد، خطای فاحشی ایجاد می‌شود. Drift، ثابت‌قدم بودن اسپکتروفتومتر را کنترل می‌کند.
روش کنترل:
به ازای هر 20-10 خوانش، یک‌بار بلانک را به دستگاه می‌دهیم که نباید تغییر کند و در صورت وجود Drift در فواصل کوتاه، دستگاه را صفر کنیم یا مقدار بالا یا پائین‌رفته را از عدد خوانده شده تست‌ها کم یا زیاد می‌کنیم.
راه دیگر بررسی رانش فتومتری این است که ابتدا دستگاه را با درابکین صفر کرد و سپس محلول سیانومت هموگلوبین را در کووت ریخته و سر آن را با پارافیلم محکم نمود وجذب نوری این محلول هر 15-5 دقیقه بمدت یکساعت اندازه گیری نمود. حداکثر تغییر مجاز در جذب های نوری قرائت شده طی این مدت 0.005± می باشد.
کدورت محلول‌ها: برای اندازه‌گیری فتومتری، معرف‌ها و محلول‌های حاصل باید شفاف باشند. در صورت کدورت، واکنش باید تکرار شود. آزمایش را با رقیق کردن نمونه تکرار کنید و یا به‌صورت Sample blank عمل کنید و جذب نوری بلانک نمونه را از سایر لوله‌ها کم کنید.
کنترل SBW (Spectral Band Width): برای کنترل SBW اسپکتروفتومتر از روش‌های زیر استفاده می‌شود:
لامپ بخار جیوه (Mercury Vapor Lamp)
Interference Filter با SBW معادل 2-1 نانومتر
اگر SBW به‌دست‌آمده دستگاه با روش فوق با SBW ادعا شده دستگاه تفاوت داشت، هیچ کار نمی‌توان انجام داد، به جز این‌که تست‌های آنزیمی حساس با این دستگاه خوانده نشود.
(Cuvette matching) یکسانی کووت‌ها: میزان جذب نوری تمام کووت‌هایی که برای اندازه‌گیری و کالیبراسیون به کار می‌روند باید یکسان باشند.
روش کنترل کووت:
استفاده از آب مقطر: تمام کووت‌ها را از آب مقطر پر می‌کنیم و دستگاه را با کووت اول صفر می‌کنیم و جذب کووت‌های دیگر را اندازه می‌گیریم. نباید بیش از±0.01با هم تفاوت داشته باشند.
استفاده از محلول سیان مت هموگلوبین: با محلول درابکین و طول‌موج مناسب دستگاه را صفر می‌کنیم. در کووت اولی محلول سیان‌مت هموگلوبین ریخته و در دستگاه قرار می‌دهیم و T را یادداشت می‌کنیم. همان محلول را با سایر کووت‌ها می‌خوانیم. هر کووت که بیش از 0.015با سایر کووت‌ها تفاوت داشته باشد را کنار می‌گذاریم.
طیف ناخواسته یا (Stray light):
به معنی وجود طول‌موج‌های ناخواسته در نور خارج‌شده از مونوکروماتور می‌باشد که باعث تداخل و خطا می‌شود. وجود Stray light را به‌وسیله اندازه‌گیری درصد عبور نور از درون ماده‌ای که در طول‌موج مشخصی دارای عبور نوری 5% (جذب نوری 100%) می‌باشد تعیین می‌کنند. میزان عبور نور در این طول‌موج به علت وجود Stray light می‌باشد. عبور نور از محلول‌های زیر در طول‌موج‌های ذکرشده برابر 5% می‌باشد و از محلول‌های زیر برای اندازه‌گیری Stray light استفاده می‌شود.
کلرید پتاسیم (KCl) 12 گرم در لیتر در طول‌موج 200 -nm 175
استون در طول‌موج 320-250 nm.
سدیم نیتریت 50 گرم در لیتر در طول موج 385-300 نانومتر
روش کار:
طول‌موج مناسب را بر روی دستگاه انتخاب کرده و دستگاه را روشن می‌کنیم، سپس دستگاه را بر روی صفر و بعد با طول‌موج روی 100% عبور نور تنظیم می‌کنیم. طول‌موج به مقدار اولیه برگردانده می‌شود و درصد عبور نور در آن طول‌موج قرائت می‌شود. اگر T بالاتر از %0 باشد وجود Stray light را نشان می‌دهد. اگر T بالاتر از 2% باشد Stray light غیرقابل قبول است.
توجه : آزمايشگاههايي که از فتومتر استفاده مي‌نمايند ، ازبين پارامترهاي گفته شده تنها مي‌توانند خطي بودن، رانش فتومتري و انوار ناخواسته را بررسي نمايند. ساير موارد ذکر شده و همچنين دماي محفظه بايد از طريق شرکت پشتيبان بررسي شود
منابع:
تکنیک‌های عملی آزمایشگاه تشخیصی جلد ششم، کنترل کیفی مواد و تجهیزات آزمایشگاهی PAS
بیوشیمی تیتز
کنترل کیفیت در آزمایشگاه‌های پزشکی، دکتر فریده رضی، آزمایشگاه مرجع سلامت
بیوشیمی هنری دیویدسون 2011
استاندارد آزمایشگاه‌های بالینی امریکا CLSI 2006
کتاب جامع تجهیزات آزمایشگاه، حمیدرضا سقا
تضمین کیفیت در آزمایشگاه‌های تشخیص طبی و کنترل کیفی آزمایش‌ها و تجهیزات (سیما ذوالفقاری انارکی، نشر طبیب)
اصول کنترل کیفی و تضمین کیفیت، زهرا خاتمی
برای دانلود پی دی اف بر روی لینک زیر کلیک کنید
ورود / ثبت نام