مباحثی پیرامون استانداردسازی در روش‌های ایمونواسی
قسمت دوم : امکان‌پذیری استانداردسازی
دکتر محمدرضا ملک، PhD بیوشیمی از مرکز تحقیقات بیوشیمی و بیوفیزیک دانشگاه تهران
مشاور و مدرس سیستم‌های مدیریت کیفیت در آزمایشگاه‌های تشخیص پزشکی
مقدمه
اساس روش‌های ایمونواسی بر پایه اتصال آنتی‌بادی‌های اختصاصي به آنتی‌ژن مربوطه است. واکنش‌های اختصاصی بین آنتی‌ژن و آنتی‌بادی به دو صورت اولیه و ثانویه صورت می‌پذیرد. واکنش‌های اولیه شامل اتصال اولیه آنتی‌ژن با دو یا چند ظرفیت مولکول آنتی‌بادی است که مستقیماً قابل رؤیت نیستند و برای مشاهده این واکنش‌ها، آنتی‌بادی یا آنتی‌ژن را به‌وسیله موادی چون رادیواکتیو، فلورسنت، آنزیم، لیبل‌های کمی‌لومینسانس و الکتروکمی‌لومینسانس نشاندار کرده و به ترتیب روش‌های رادیوایمونواسی (RIA)، فلورسنت ایمونواسی (FIA)، آنزیم ایمونواسی (EIA)، کمی‌لومینسانس (CLA) و الکتروکمی‌لومینسانس (ECLA) نامیده می‌شوند. امروزه کاربرد روش‌های نوین ایمونواسی مانند کمی‌لومینسانس و الکتروکمی‌لومینسانس که هر دو بر اساس میزان نشر نور توسط اتم‌های برانگیخته حاصل از انجام واکنش‌های شیمیایی (در الکترو کمی‌لومینسانس انجام واکنش‌های شیمیایی در سطح الکترود است) می‌باشند، رو به گسترش است. استفاده از این روش‌ها نسبت به روش‌های پیشین مانند رادیو ایمونواسی و الایزا به دلایل مختلف از جمله افزایش حساسیت و ویژگی به علت استفاده از آنتی‌بادی‌های تخلیص‌شده و اختصاصی، محدوده وسیع‌تر دامنه خوانش، کاهش زمان انکوباسیون و غیره، روند تأیید و تفسیر نتایج آزمایشگاهی را به شکل قابل توجهی بهبود و تسهیل بخشیده است.
وسعت یافتن دامنه خطی بودن روش‌های جدید ایمونواسی باعث شده است تا غلظت‌های بالای آنالیت بدون رقیق‌سازی نمونه و با دقت و صحت کافی قابل اندازه‌گیری باشند. از طرفی حساسیت بالای این روش‌ها، توانایی شناسایی و اندازه‌گیری مقادیر بسیار جزئی از آنالیت را ممکن ساخته است. استفاده از آنتی‌بادی‌های منوکلونال اختصاصی سبب افزایش ویژگی و اختصاصی بودن روش‌های نوین ایمونواسی شده و به این ترتیب احتمال بروز واکنش‌های غیراختصاصی به حداقل رسیده است، همچنین با افزایش حساسیت و ویژگی این روش‌ها، احتمال بروز نتایج منفی یا مثبت کاذب به شکل قابل توجهی کاهش یافته است. بعد از واکنش‌های اولیه در صورتی که مقادیر کافی از مولکول‌های آنتی‌ژن و آنتی‌بادی وجود داشته باشد، واکنش‌های ثانویه که تجلی اجتماعی از چندین مولکول آنتی‌ژن و آنتی‌بادی است و به‌صورت واکنش‌های رسوبي يا پرسيپيتاسيون، واکنش‌های آگلوتیناسیون و واکنش‌های فلوكولاسيون طبقه‌بندی می‌شوند، اتفاق خواهد افتاد. به دلیل خصوصیات عملکردی و تنوع روش‌های ایمونواسی، استفاده از آنها در اندازه‌گیری کمی و کیفی آنالیت‌های مختلف کاربرد وسیعی پیدا کرده است، لذا توجه به موضوع استانداردسازی و آگاهی از موانع و مشکلات این فرآیند از اهمیت قابل توجهی برخوردار است. در خصوص استانداردسازی آنالیت‌ها و بیومارکرهای تشخیصی تحقیقات فراوانی تا به امروز انجام شده است و این تلاش‌ها کماکان ادامه دارد.
اهمیت استانداردسازی در روش‌های ایمونواسی
پروژه‌های استانداردسازی در روش‌های ایمونواسی با هدف بهبود خصوصیات عملکردی روش اندازه‌گیری و در جهت افزایش قابلیت اطمینان نتایج آزمایش‌ها طرح‌ریزی و اجرا می‌گردد. طی دهه‌های اخیر علی‌رغم توفیقاتی که به دنبال استاندارد کردن روش‌های ایمونواسی در افزایش تکرارپذیری درون آزمایشگاهی، کاهش خطاهای سیستماتیک، گسترش دامنه خوانش، افزایش حساسیت جهت اندازه‌گیری آنالیت‌ها با مقادیر بسیار کم، افزایش ویژگی و کاهش واکنش‌های غیر اختصاصی، کاهش Carry Over، کاهش مصرف معرف‌ها و افزایش سرعت جوابدهی به دنبال استفاده از سیستم‌های اتوماسیون حاصل شده است، لیکن چالش‌هایی چون عدم تولیدپذیری (Reproducibility) داده‌های اندازه‌گیری، وجود واکنش‌های متقاطع (Cross-Reaction) و اثر زمينه(Matrix effect) در کنار سایر عوامل مداخله‌گر، اشکالاتی را در تفسیر نتایج آزمایش‌های فراهم آورده که علاوه بر ایجاد سردرگمی برای پزشکان، بیماران را نیز دچار نگرانی می‌کند. بر همین اساس، استانداردسازی روش‌های ایمونواسی می‌تواند به تسهیل در روند تأیید و تفسیر نتایج آزمایش‌هایی نظیر هورمون‌ها، تومور مارکرها، آنتی‌بادی‌های میکروبی، اتو آنتی‌بادی‌ها و غیره به آزمایشگاه‌ها و پزشکان کمک نماید، همچنین با استاندارد کردن روش‌های ایمونواسی، امکان مقایسه نتایج آزمایش یک آنالیت بر روی یک نمونه فراهم شده و به تصمیم‌گیری در مورد عملکرد روش اندازه‌گیری در فرآیند صحه‌گذاری (Method Validation) کمک می‌نماید. اهمیت استانداردسازی در روش‌های ایمونواسی بخصوص در آزمایش‌هایی که با مقاصد غربالگری (Screening) انجام می‌شود، حائز اهمیت است. از دیگر مزایای استانداردسازی، امکان پایش روند بیماری (Monitoring of Disease) در بیماران است که در این ارتباط تحقیقات زیادی در خصوص استانداردسازی سنجش انواع تومورمارکرها صورت گرفته است که در شماره‌های آینده به تفصیل به آن اشاره خواهد شد.
برخی از علل مؤثر در عدم تولیدپذیری نتایج آزمایش
در قسمت اول از این مبحث به اهمیت داده‌ها در علم مترولوژی یا اندازه‌گیری اشاره گردید، همچنین ذکر شد که ارزیابی پارامتر دقت شامل هر دو معیار تکرارپذیری و تولیدپذیری داده‌های اندازه‌گیری است و در بررسی داده‌ها از اهمیت و اولویت بالایی برخوردار است. اشاره شد که بعضاً در اندازه‌گیری برخی از آنالیت‌ها و بیومارکرهای تشخیصی به روش ایمونواسی که به دلایل مختلف امکان استانداردسازی آنها میسر نشده است یا امکان‌پذیر نیست، شاهد اختلاف بین نتایج اندازه‌گیری در بین روش‌های مختلف هستیم که علی‌رغم وجود دقت و تکرارپذیری درون آزمایشگاهی و برخورداری از صحت نسبی، لیکن نتایج از تولیدپذیری قابل قبولی برخوردار نیستند. این موضوع با توجه به تنوع روش‌های ایمونواسی، به یکی از مهم‌ترین چالش‌های حال حاضر در آزمایشگاه‌های بالینی تبدیل شده است. عوامل متعددی در بروز نتایج ضد و نقیض و عدم تولیدپذیری مقادیر آزمایش در روش‌های ایمونواسی دخالت دارند. از طرفی موانع و چالش‌های استانداردسازی برای آنالیت‌های مختلف، یکسان نبوده و به عوامل گوناگونی وابسته است. ناهمگونی یا هتروژنی (Heterogeneity) ساختار آنتی‌ژن، تفاوت در ویژگی آنتی‌بادی‌ها، بروز واکنش‌های متقاطع، تفاوت در قدرت تعامل بین آنتی‌ژن و آنتی‌بادی، تفاوت در نوع نمونه‌های استاندارد، تفاوت در فرآیند کالیبراسیون و گوناگونی خصوصیات عملکردی در بین روش‌های ایمونواسی از جمله عواملی هستند که سبب می‌شوند تا از تکرار اندازه‌گیری برخی از آنالیت‌های تشخیصی با روش‌های ایمونواسی مختلف، نتایج یکسانی حاصل نشود.
ناهمگونی یا هتروژنی مولکول‌های پپتیدی یا پروتئینی، سبب عدم یکنواختی واکنش آنتی‌بادی علیه مولکول مربوطه می‌شود. نوع آنتی‌بادی استفاده‌شده در روش اندازه‌گیری نیز با توجه به اینکه اساس واکنش‌های ایمونواسی بر پایه واکنش اختصاصی مولکول‌های آنتی‌بادی به آنتی‌ژن است، بسیار مهم است؛ بنابراین تفاوت‌های ساختاری بین آنالیت‌ها و متابولیت‌های آنها، نوع آنتی‌بادی واکنشگر، منوکلونال یا پلی‌کلونال بودن آنتی‌بادی، درجه ویژگی (Specificity) و قدرت اتصال (Affinity) آنتی‌بادی در بروز نتایج مختلف آزمایش مؤثر هستند. بر این اساس به منظور کاهش نتایج مثبت و منفی کاذب، بسیاری از تلاش‌های صورت گرفته در پروژه‌های استانداردسازی روش‌های ایمونواسی، متمرکز بر تولید آنتی‌بادی‌های منوکلونال با قدرت اتصال و درجه ویژگی بالا است. یکی دیگر از دلایل مرتبط با موضوع استانداردسازی که بعضاً باعث اختلال در روند تأیید و تفسیر نتایج آزمایشگاهی می‌گردد، تفاوت‌های عمده و اساسی در فرآیند کالیبراسیون بین روش‌های مختلف اندازه‌گیری است. عدم وجود نمونه مرجع یکسان در روش‌های مختلف که توسط شرکت‌های مختلف ساخته می‌شوند، باعث ایجاد تفاوت در فرآیند کالیبراسیون شده و بدین ترتیب نتایج حاصل از اندازه‌گیری یک آنالیت نظیر یک هورمون یا تومورمارکر که فاقد یک نمونه مرجع استاندارد هستند، بین روش‌های اندازه‌گیری مختلف، متفاوت خواهد بود. توجه به این موضوع با وجود تنوع روش‌های ایمونواسی که برای اندازه‌گیری کیفی و کمی آنالیت‌های تشخیصی وجود دارند، بسیار مهم است.
موانع و چالش‌ها
استانداردسازی روش‌های اندازه‌گیری در آزمایشگاه‌های تشخیص پزشکی یک مفهوم نسبتاً جدید است که امکان انجام آن وابسته به وجود مواد مرجع و استفاده از روش‌های قطعی یا مرجع است. استانداردهای اولیه با درجه خلوص بالا، مواد مرجع استاندارد (SRM) و روش‌های مرجع برای بسیاری از آنالیت‌های تشخیصی که به‌وسیله روش‌های مرسوم و متداول بیوشیمی سنجش می‌شوند، در دسترس است، در صورتی که این امکان برای بسیاری از بیومارکرها که با روش‌های ایمونواسی اندازه‌گیری می‌شوند وجود ندارد و به دلایل مختلف توسعه کمتری داشته است.
بیشتر طرح‌ها و پروژه‌های بین‌المللی استانداردسازی در روش‌های ایمونواسی را می‌توان بر اساس آنالیت‌های تشخیصی به دو گروه عمده طبقه‌بندی نمود؛ گروه اول مربوط به ترکیباتی است که تحت عنوان هاپتن نامیده می‌شوند. هاپتن‌ها برخلاف بسیاری از آنتی‌ژن‌ها که دارای چندین اپی‌توپ هستند، تنها یک اپی‌توپ دارند و در آزمایشگاه از آنتی‌بادی که علیه آنها تولید می‌شود، جهت اندازه‌گیری ﻣﻘﺎدﻳﺮ بسیار جزئی از داروﻫﺎ و هورمون‌ها نظیر هورمون‌های استروئیدی به روش ایمونواسی اﺳﺘﻔﺎده می‌شود. در اینجا لازم به یادآوری است که آنتی‌ژن‌ها شامل ماکرومولکول‌ها، میکروارگانیسم‌ها یا سلول‌های مختلفی هستند که در نتیجه ورود به بدن قادرند سیستم ایمنی را علیه خودشان به‌طور اختصاصی تحریک نمایند. قسمت‌هایی از ساختار آنتی‌ژن که قادر است سیستم ایمنی را تحریک کند یا به مولکول‌های آنتی‌بادی متصل شود را اپی‌توپ (Epitope) می‌نامند. چنانچه اپی‌توپ‌ها فقط در یک آنتی‌ژن مشخص وجود داشته باشند، اختصاصی (Specific) و اگر در بین چند آنتی‌ژن مشترک باشند، اشتراکی (Cross-reacting) نامیده می‌شوند. آنتی‌ژن‌هایی را که با یکدیگر تشابه دارند در اصطلاح آنتی‌ژن‌های هتروفیل یا هتروژنیک (Heterogenetic) می‌نامند.
گروه دوم ترکیباتی با ساختار پپتیدی یا پروتئینی هستند که اکثراً به لحاظ ساختاری هتروژن می‌باشند. نکته قابل توجه در این است که چالش‌های استانداردسازی این دو گروه از ترکیبات یکسان نبوده و بر اساس ساختار آنها متفاوت است. استانداردهای خالص و روش‌های مرجع مانند طیف‌سنجی جرمی (Mass Spectrometry) برای سنجش بسیاری از هورمون‌های استروئیدی در دسترس است. این در حالی است که برای ترکیباتی با ساختار پپتیدی یا پروتئینی به دلایل مختلف، تهیه مواد استاندارد و استفاده از روش‌های مرجع به‌راحتی میسر نیست. همانطوریکه اشاره شد در بسیاری از موارد ساختار آنالیت‌های پپتیدی و پروتئینی به علت هتروژن بودن با ساختار مواد استاندارد متفاوت است و بنابراین توسعه و پیشبرد استانداردسازی این گروه از ترکیبات نسبت به هورمون‌های استروئیدی روند آهسته‌تر و طولانی‌تری را دارا است.
آیا امکان استانداردسازی برای همه آنالیت‌ها وجود دارد؟
برخی از محققان بر این باور هستند که امکان استانداردسازی روش‌های ایمونواسی برای آنتی‌ژن‌هایی که ساختار هتروژن دارند در مقایسه با سایر ترکیبات بسیار سخت است و شاید غیرممکن باشد. همانطوریکه قبلاً نیز اشاره شد، دسترسی به مواد استاندارد خالص و روش‌های مرجع، دو پیش‌نیاز اصلی جهت انجام پروژه‌های استانداردسازی است. استانداردهای اولیه باید هموژن، خالص و به لحاظ ساختاری مشابه با آنالیتی باشند که قرار است در نمونه بیولوژیک اندازه‌گیری شود. بدیهی است که این نیازها برای تعداد محدودی از آنالیت‌ها در دسترس است. روش‌های مرجع معمولاً به دو گروه اولیه و ثانویه طبقه‌بندی می‌شوند؛ روش‌های اولیه که تحت عنوان روش‌های قطعی نیز از آنها نام برده می‌شود، روش‌هایی هستند که کمترین میزان خطا را داشته و دارای بالاترین میزان دقت و صحت هستند. همانطوریکه قبلاً اشاره شد، روش طیف‌سنجی جرمی یکی از روش‌های مرجع است که برای سنجش آنالیت‌هایی نظیر هورمون‌های استروئیدی و برخی از هورمون‌های دیگر کاربرد دارد. اگرچه در مورد هورمون‌های استروئیدی روش‌های مرجع در دسترس هستند، ولی بروز واکنش‌های متقاطع به عنوان چالش اصلی استانداردسازی این گروه از ترکیبات شناخته می‌شوند.
نتیجه‌گیری
استانداردسازی آنالیت‌های تشخیصی در صورتی ممکن است که ساختار ماده استاندارد و آنالیت مورد اندازه‌گیری یکسان باشند. تهیه ماده استاندارد به دلیل وجود ساختار هتروژنی ترکیبات پپتیدی و پروتئینی (به غیر از برخی از پپتیدهای کوچک) برای پروتئین‌های بزرگ‌تر که دارای اشکال و قطعات مختلفی در نمونه‌های بیولوژیک هستند، سخت به نظر می‌رسد. بسیاری از هورمون‌ها و تومورمارکرها ساختار گلیکوپروتئینی دارند. این ترکیبات ذاتاً هتروژن بوده و در واقع تهیه یک نمونه استاندارد گلیکوپروتئینی که ساختار آن شبیه به ساختار آنالیت باشد، به‌راحتی امکان‌پذیر نیست. اگرچه هنوز محققان به راه حل مشخصی در خصوص استانداردسازی ترکیبات هتروژن دست پیدا نکرده‌اند، لیکن آگاهی هر چه بیشتر از موانع و چالش‌های استانداردسازی و داشتن نگاهی واقع بینانه در این خصوص، راهگشای این فرآیند در حال و آینده خواهد بود. در شماره‌های بعد این موضوع را با جزئیات بیشتر بررسی خواهیم نمود.
استانداردسازی در روش‌های ایمونواسی (1)
بیولومینسانس و کاربرد آن در روش‌های ایمونواسی
برای دانلود پی دی اف بر روی لینک زیر کلیک کنید
ورود / ثبت نام