آنالیز شکست کروموزومی – کم‌خونی فانکونی

آنالیز شکست کروموزومی – کم‌خونی فانکونی

برای شناسایی شکست کروموزومی و اشکال رادیال، ویژگی‌های مشخصه کم‌خونی فانکونی مرتبط با فقدان ترمیم شکست کروموزومی

دکتر میرمجید مصلائی

آزمایشگاه پاتوبیولوژی و ژنتیک پارسه

کم‌خونی فانکونی (FA) یک بیماری ناهمگون از نظر بالینی و ژنتیکی است که توسط موتاسیون‌ها در یکی از 15 ژن مختلف دخیل در ترمیم DNA ایجاد می‌شود. بدون در نظر گرفتن شدت بیماری، ویژگی‌های مشخصه FA، وجود شکست کروموزومی است.
نکات برجسته تست

• پیشینه بالینی
• FA به وسیله عقب ماندگی رشدی، ناهنجاری‌های فیزیکی و ناهنجاری‌های خونی مشخص می‌شود.
• FA با نقص ترمیم DNA که به وسیله بروز موتاسیون در حداقل 15 ژن مختلف رخ می‌دهد، در ارتباط است. این ژن‌ها عبارتند از: BRCA2, BRIP1, FANCA, FANCB, FANCC, FANCD2, FANCE, FANCF, FANCG, FANCI, FANCL, FANCM, PALB2, RAD51C و SLX4
• افزایش نرخ شکست‌های خودبخودی کروموزومی در سلول‌های افراد بیمار پس از مواجهه با عوامل کلاستوژن، مشاهده شده است.
• مروری بر بیماری
• اغلب بیماران (75-60%) مبتلا به FA، دارای یک یا چند ناهنجاری فیزیکی مشخص هستند که شامل ناهنجاری شست‌ها، ساعدها، چشم‌ها، گوش‌ها، قلب و کلیه‌ها می‌شود. به علاوه این افراد معمولاً دچار کوتاهی قد و تغییرات رنگدانه نیز هستند.
• نقص مغز استخوان که منجر به کم‌خونی، پان‌سیتوپنی یا کم شدن تمام عناصر خونی، ترومبوسیتوپنی، و یا لوکوپنی می‌شود، معمولاً قبل از سن 10 سالگی رخ می‌دهد.
• در افراد مبتلا بروز سرطان نیز شایع است.
• مطالعه شیوع بیماری
• رخداد FA در تمامی جمعیت‌ها حدوداً یک در 360000 تولد با فرکانس ناقلین یک در 300 است.
• حدوداً 1/89 افراد توارث یهودی اشکنازی، حامل یک موتاسیون در FANCC هستند.
• ریسک ناقل بودن در دیگر جمعیت‌ها مانند کولی‌های اسپانیایی و سیاهپوستان آفریقای جنوبی افزایش یافته و حدود 1 به 100 می‌باشد.
• ژنتیک
• 15 گروه مختلف متمم شناخته شده است.
• اغلب توارث‌ها به صورت اتوزومال مغلوب است.
• توارث FANCB مغلوب وابسته به X است.
• موارد درخواست تست
• این آزمایش برای افراد زیر مناسب است:
• آنومالی‌های فیزیکی مشخص
• نارسایی پیشرونده مغز استخوان
• کم‌خونی آپلاستیک با ماکروسیتوز گلبول قرمز و افزایش سطح هموگلوبین F که در بزرگسالی بروز کرده و شروع می‌شود.
• تومورهای جامد که در سنین جوانی به صورت غیر معمول و در غیاب دیگر فاکتورهای خطر ایجاد شده‌اند.
• واکنش‌های توکسیک غیر معمول به شیمی درمانی یا رادیوتراپی
• همانطور که 25 تا 40% از افراد مبتلا هیچ ناهنجاری فیزیکی ندارند، آزمایش برای خواهر و برادرهای بدون علائم فرد مبتلا یا فرزندان بدون علائم ناقلین شناخته شده پیشنهاد می‌شود.

 تفسیر آزمایش

• نتایج به صورت تعداد سلول‌ها با اشکال رادیال گزارش می‌شود.
• همچنین تعداد میانگین شکست در هر سلول (در سلول‌ها بدون رادیال) نیز گزارش می‌شود.
• کشت میتومایسین MMC)C): در ارتباط با کنترل نرمال تفسیر می‌شود.
• کشت دی اپوکسیبوتان (DEB): در ارتباط با نرخ شکست‌های DEB تثبیت شده تفسیر می‌شود.
• منفی: عدم وجود اشکال شعاعی و کمتر از 0/5 شکست در هر سلول
• مثبت: رادیال‌های چندگانه و بیشتر از 1/0 شکست در هر سلول
• مبهم: تعداد اندک یا عدم وجود رادیال‌ها و 0/5 تا 1/0 شکست در هر سلول
• محدودیت‌های تست
• ناقلین نمی‌توانند بوسیله این تست شناسایی شوند.
• مواد و روش‌ها 
• کشت تحریک شده با استرس‌های کلاستوژن، آنالیز شکست باند نشده
• خون محیطی با یک میتوژن سلول T، فیتوهماگلوتینین، در حضور و غیاب DEB و MMC کشت داده می‌شود.
• مجموع 50 سلول متافازی از هر دو کشت، نمره داده شده و برای شکست کروموزومی و همچنین تشکیل رادیال‌ها آنالیز می‌شوند.
• تست‌های مرتبط
• شکست -آنالیز کرموزومی، آتاکسیا تلانژیکتازیا، تمام اجزای خون
• رفرانس‌ها

1. Soulier J. Fanconi anemia. Am Soc Hematol Educ Book. Hematology. 2011;2011(1)492–497.
2. Auerbach AD. Diagnosis of fanconi anemia by diepoxybutane analysis. Curr Protoc Hum Genet. 2003;Chapter 8:Unit 8.7.

بیماری گرانولوماتوز مزمن

(پایش ژن CYBB و حذفGT  اگزون 2 ژن NCF1)

برای تأیید تشخیص یا تعیین حالت ناقل برای بیماری گرانولوماتوز مزمن

 مروری بر بیماری

• CGD بیماری نقص سیستم ایمنی اولیه است که توسط عفونت‌های قارچی و باکتریایی شدید و مکرر پوست، غدد لنفاوی، کبد، ریه‌ها، استخوان‌ها یا اندام‌های احشایی، مشخص می‌شود.
• پاسخ‌های التهابی تنظیم نشده، منجر به گرانولوم در سایت‌های عفونت می‌شود. دیگر یافته‌ها شامل ذات‌الریه، نشانه‌ها و علائم عفونت سیستمیک، دیر بهبود پیدا کردن زخم‌ها، هایپرگاماگلوبولینمیا یا افزایش گاما گلوبولین در خون، بزرگی طحال، التهاب مشیمیه و شبکیه، کولیت، یا انسداد مجاری ادراری یا خروجی معده می‌شود.
• CGD ناشی از تغییرات ژنتیکی درون ژن‌های رمز کننده زیرواحدهای حیاتی کمپلکس نیکوتین آمید آدنین دی نوکلئوتید فسفات (NADPH) اکسیداز است که گونه‌های اکسیژن واکنشی را که برای کشتن میکروارگانیزم‌های باکتریایی و قارچی ضروری است، تولید می‌کند. لوکوسیت‌های اشخاص مبتلا به CGD قادر به تولید سوپراکسید، هیدروژن پراکسید، یون هیدروکسیل و هیپوکلوروس اسید که برای تخریب درون سلولی پاتوژن‌های فاگوسیت شده ضروری است، نیستند. عوامل عفونی شایع شامل گونه‌های استفیلوکوکوس آئروس، بورک هولدریا سپاسیا، سراشیا مارسسنز، نوکاردیا و آسپرژیلوس می‌شوند.
• در افراد مبتلا به CGD وابسته به X، که در اثر موتاسیون در ژن CYBB ایجاد شده است، عموماً ظهور بیماری سریع‌تر و شدت آن نسبت به افراد مبتلا به CGD وابسته به X گونه دیگر یا CGD اتوزومال مغلوب بیشتر است.
• مردان مبتلا به CGD وابسته به X کلاسیک عموماً قبل از 3 سالگی شناسایی می‌شوند، با این حال، فنوتیپ‌های خفیف‌تری نیز مشاهده شده است.
• تقریباً نیمی از زنانی که حامل CGD وابسته به X هستند، علائم خفیفی شامل حساسیت به نور (یا دیگر ضایعات پوستی شبه لوپوس) و زخم‌های دهانی مکرر و عود کننده را بروز می‌دهند. به ندرت، زنان ناقل ممکن است بیماری شدید را به واسطه غیرفعال شدن نامتقارن کروموزوم X نشان دهند. به منظور غربالگری قابل اعتماد ناقلین برای CGD وابسته به X، به آزمایشات مولکولی نیاز است.

 شرایط بالینی

• CGD عموماً با استفاده از آزمایشات عملکردی برای تشخیص غیاب یا کاهش فعالیت اکسیداز در نوتروفیل‌های فعال شده (مانند آزمایش انفجار تنفسی) شناسایی می‌شود. افراد مبتلا به CGD وابسته به X یا CGD اتوزومال مغلوب، در آنالیزهای عملکردی، کاهش یا عدم فعالیت NADPH اکسیداز را نشان می‌دهند.
• از آنجا که مدیریت بیماری به مصرف آنتی‌بیوتیک‌های مادام‌العمر و داروهای پیشگیری ضد قارچ بستگی دارد، تشخیص زودهنگام این بیماری از اهمیت ویژه‌ای برخوردار است. پیوند سلول‌های بنیادی آلوژن می‌تواند در موارد حاد، اثربخش باشد.
• تعیین علت ملکولی CGD برای شروع مصرف داروهای پیشگیری کننده ضد میکروبی، مشاوره ژنتیک، و تشخیص پیش از تولد ضروری است.
• مطالعه شیوع بیماری
• وقوع CGD در ایالات متحده حدود 1 در میان هر 250 هزار تولد است.
• CGD وابسته به X، که توسط موتاسیون در ژن CYBB ایجاد شده است، 60 تا 70% از کل موارد CGD را شامل می‌شود.
• CGD اتوزومال مغلوب، که توسط موتاسیون‌های ژن NCF1 ایجاد می‌گردد، 25% کل موارد را شامل می‌شود.
• CGD اتوزومال مغلوب که توسط موتاسیون‌های ژن CYBA ایجاد می‌شود، کمتر از 5% کل موارد بیماری را شامل می‌شود.
• CGD اتوزومال مغلوب که توسط موتاسیون‌های ژن NCF2 ایجاد می‌شود، کمتر از 5% کل موارد بیماری را شامل می‌شود.
• ژنتیک
• CYBB تنها ژن شناخته شده مرتبط با CGD وابسته به X است. CYBB، زیرواحد p91-phox (Nox2) را در کمپلکس NADPH اکسیداز رمز می‌کند.
• تقریباً 10 تا 20% از موتاسیون‌های ژن CYBB، de novo هستند.
• بیش از 600 موتاسیون پاتوژنیک ژن CYBB گزارش شده است. به طور تقریبی، 90% از موتاسیون‌های ژن CYBB، الحاق‌ها، حذف‌ها و یا جایگزینی‌های کوچک نوکلئوتیدی هستند، در حالی که تقریباً 10% از موتاسیون‌های عامل بیماری، حذف‌های بزرگ می‌باشند.
• شدت بیماری را می‌توان به وسیله سطح فعالیت NADPH اکسیداز مرتبط با موتاسیونی ویژه در ژن CYBB، تخمین زد. با این حال، موتاسیون‌های یکسان CYBB در افراد مختلف می‌تواند منجر به پیامدهای بالینی مختلفی گردد که این موضوع بیانگر دخالت تعدیل کننده‌های محیطی یا ژنتیکی اضافی در بیماری می‌باشد.
• CGD اتوزومال مغلوب از بروز موتاسیون در دیگر ژن‌های رمز کننده اجزای کمپلکس NADPH اکسیداز ناشی می‌شود: NCF1، p47-phox را رمز می‌کند (25%)، CYBA، p22-phox را رمز می‌کند (کمتر از 5%)، NCF2 ، p67-phox را رمز می‌کند (کمتر از 5%) و NCF4، p40-phox را رمز می‌کند (بسیار نادر).
• یک موتاسیون واحد، یک حذف GT در اگزون 2، عامل اکثر موتاسیون‌های ژن NCF1 است.
• موارد درخواست آزمایش
• برای تأیید تشخیص بالینی یا آزمایشگاهی CGD
• برای تعیین عامل مولکولی CGD در یک فرد بیمار به منظور آغاز مصرف داروهای پیشگیری کننده ضد میکروبی مناسب.
• غربالگری ناقلین برای افراد دارای سابقه فامیلی CGD، زمانی که موتاسیون فامیلی ویژه شناخته نشده باشد.
• تفسیر آزمایش
• تشخیص یک جهش پاتوژنیک ژن CYBB در یک بیمار مرد دارای علائم، وجود CGD مرتبط با X را تأیید می‌کند. تشخیص یک جهش پاتوژنیک ژن CYBB در یک بیمار زن بدون علائم، ناقل بودن وی را تأیید می‌کند. فرزندان پسر یک خانم ناقل، 50% ریسک ابتلا به CGD وابسته به X داشته و فرزندان دختر وی 50% ریسک ناقل شدن دارند.
• تشخیص دو نسخه از حذف GT در NCF1 در افراد دارای علامت وجود CGD اتوزومال مغلوب را تأیید می‌کند.
• شناسایی یک نسخه از حذف GT در NCF1، حالت ناقلی را برای CGD اتوزومال مغلوب اثبات می‌کند.
• همچنین تعیین توالی/ غربالگری ژن می‌تواند موتاسیون‌های جدید اهمیت‌های بالینی ناشناخته را شناسایی کند.
• محدودیت‌های تست
• فقدان یک جهش ژنی CYBB قابل شناسایی و حذف GT شایع در NCF1، وجود CGD را رد نمی‌کند، زیرا تمامی جهش‌های عامل بیماری توسط این تست قابل شناسایی نیستند.
• موتاسیون‌های عمیق داخل اینترونی در CYBB، جهش‌های دیگر NCF1 به غیر از حذف GT در اگزون 2 و جهش‌ها در دیگر ژن‌های مرتبط با CGD، در زنان و مردان قابل شناسایی نیستند.
• حذف‌ها/ مضاعف شدن‌های بزرگ ژن CYBB در زنان قابل شناسایی نیستند.
• نقاط شکست ویژه از حذف‌ها/ مضاعف شدن‌های بزرگ ژن CYBB نیز در مردان قابل تشخیص نیستند.
• خطاهای تشخیصی نادر نیز می‌تواند به علت موتاسیون‌های محل پرایمر رخ دهد.
• به علت نوترکیبی بالقوه میان NCF1 و شبه ژن‌های آن، عدم شناسایی حذف GT در اگزون 2 نمی‌تواند حالت ناقل CGD اتوزومال مغلوب را رد کند.
• برای آزمایش خویشاوندان برای یک واریانت توالی شناخته شده CYBBفامیلی باید موتاسیون فامیلی و تعیین توالی هدفمند درخواست داده شود.
• حساسیت بالینی غربالگری ژن CYBB با شناسایی حذف GT در ژن NCF1، 86% است.
• حساسیت تحلیلی برای ژن CYBB و حذف هموزیگوت GT، 99% است و این حساسیت برای حذف هتروزیگوت GT، 90% است.
• اختصاصیت تحلیلی 99% است.
• مواد و روش‌ها
• PCR توسط آنالیز ذوب با وضوح بالا (HRM) تمام ناحیه رمز کننده و محدوده‌های اینترون/ اگزون ژن CYBB دنبال می‌شود. واریانت‌های توالی شناسایی شده، با استفاده از تعیین توالی دوطرفه هدفمند، تأیید می‌شود.
• آنالیز پروب برچسب‌دار برای شناسایی حذف GT در اگزون 2 ژن NCF1 مورد استفاده قرار می‌گیرد.

 آزمایشات مرتبط

• آزمایش انفجار اکسیداتیو نوتروفیل
• غربالگری ژن CYBB مرتبط با X بیماری گرانولوماتوز مزمن در بازتاب به تعیین توالی
• حذف GT اگزون 2 ژن NCF1 بیماری گرانولوماتوز مزمن
• تعیین توالی هدفمند موتاسیون فامیلی
• :منابع

1. Brunson T, et al. A copy number variation in human NCF1 and its pseudogenes. BMC Genet. 2010;11:13.
2. Hill HR, et al. Rapid genetic analysis of X-linked chronic granulomatous disease by high-resolution melting. J Mol Diagn. 2010;12:368–376.
3. Johnston RB Jr. Clinical aspects of chronic granulomatous disease. Curr Opin Hematol. 2001;8:17–22.
4. Roos D, et al. Hematologically important mutations: X-linked chronic granulomatous disease (third update). Blood Cells Mol Dis. 2010; 45(3):246–265.
5. Seger RA. Chronic granulomatous disease: recent advances in pathophysiology and treatment. Neth J Med. 2010;68:334–340.

برای دانلود فایل pdf  بر روی لینک زیر کلیک کنید