یک کیس نادر آمنوره اولیه

یک کیس نادر آمنوره اولیه

شرح کیس

بیمار ۱۶ ساله، از نظر فنوتیپی مؤنث، با آمنوره اولیه و عدم رشد سینه‌ها و فقدان رشد مو در ناحیه زیربغل و شرمگاه، مراجعه کرده است. وی به‌جز کمبود ویتامین D و آنمی فقر آهن خفیف در کودکی، سابقه پزشکی قبلی ندارد. سابقه فامیلی اندوکرینوپاتی وجود نداشت. در معاینه، فشارخون نرمال، اضافه وزن و قد بلند در مقایسه با والدین  مشاهده شد. والدین نامبرده با هم خویشاوند نبودند.

آزمایش‌های بیوشیمیایی اولیه با استفاده از ایمونواسی، سطح هورمون لوتئینی کننده IU/L ۲۸ (در فاز فولیکولار 12/5- 1/9)، هورمون محرک فولیکولی IU/L ۱۶ (در فاز فولیکولار 10/2- 2/5) و غلظت نرمال نزدیک به پایین از ۱۷- بتا استرادیول معادل ng/mL ۰۲۶/۰ (0/019 – 0/144) را نشان داد که با اختلال عملکرد تخمدان مطابقت داشت. اندروژن‌های سرم غیرقابل تشخیص بودند: دهیدرواپی‌آندروسترون سولفات (DHEAS) < ng/mL ۳۰/۰ (148- 3852)، آندروستندیون < ng/mL 0/29 (0/29- 3/29) و تستوسترون < ng/mL 0/09 (0/14- 0/74). غلظت پروژسترون سرم با مقدار ng/mL 17/1 (مقادیر پیش از بلوغ 1/74- ۰) افزایش یافته بود در حالی که غلظت کورتیزول سرم در ساعت ۹ صبح با مقدار ng/mL 44/6 (221- 49/3) پایین بود. هورمون محرک تیروئیدی در بازه مرجع قرار داشت.

بررسی‌های بیشتر، نارسایی آدرنال را در ترشح کورتیزول تأیید کرد: بیمار دارای سطوح پلاسمایی افزایش‌یافته هورمون آدرنوکوتیکوتروپیک (ACTH) با مقدار ng/L ۱۴۳ (<ng/L ۵۰) بود و عدم پاسخ کورتیزول به µg ۲۵۰ سیناکتن مشاهده شد. سطح پایه کورتیزول سرم ng/mL 43/2 و مقدار کورتیزول سرم ۳۰ دقیقه بعد ng/mL47/9 بود. کاریوتایپ بیمار XX ۴۶ بود.

سرم بیمار برای آنالیز  با روش  (LS-MS/MS) به یک آزمایشگاه مرجع ارسال شد. مقدار ۱۷- هیدروکسی پروژسترون (۱۷- OHP) برابر ng/mL 1/36 (در فاز فولیکولار < 2/9) و نرمال، اما مقدار ۱۱- داکسی کورتیزول به‌طور چشمگیری افزایش یافته و برابر ng/mL 21/0 (2/41- 4/48) بود.

پرسش‌های مهم ۱- شایع‌ترین انواع هایپرپلازی مادرزادی آدرنال (CAH) کدام است؟ ۲- با توجه به افزایش پروژسترون و کاهش کورتیزول ۹ صبح، تشخیص احتمالی در مورد این کیس چیست؟ ۳- در کدام نوع از CAH، افزایش ۱۱- داکسی کورتیزول مورد انتظار است؟

سپس پروفایل استروئیدی ادرار با استفاده از روش (GC-MS) بررسی شد و غلظت‌های بالایی از متابولیت‌های کورتیکوسترون را نشان داد، در حالی که غلظت متابولیت‌های آندروستندیون، DHEAS و کورتیزول، همگی پایین بودند و این یافته با نتایج قبلی سازگار بود. اگرچه متابولیت‌های ۱۱- داکسی کورتیزول اندک بودند و این مسئله با افزایش ۱۱- داکسی کورتیزول سرم مطابقت نداشت.

برای برطرف ساختن این عدم تطابق، نمونه سرم بیمار به بیمارستان King’s College، لندن ارسال شد تا مجدداً با استفاده از یک LC-MS/MS دیگر آنالیز شود. این روش برای هدف قرار دادن حدواسط‌ها و محصولات مسیرهای اصلی بیوسنتز استروئيدها، طراحی شده است. با این آنالیز جدید مقدار ۱۱- داکسی کورتیزول پایین‌تر از حد قابل تشخیص بود در حالی که کورتیکوسترون به‌طور چشمگیری افزایش یافته بود و ۱۱- داکسی‌ کورتیکوسترون نیز افزایش پیدا کرده بود. مقادیر گزارش شده از آزمایشگاه اول برای ۱۷- هیدروکسی پروژسترون و کورتیزول تأیید شدند.

بحث

یافته‌های بالینی (مؤنث فنوتیپیک و کندی رشد جنسی) و بیوشیمیایی (افزایش پروژسترون و کاهش کورتیزول ۹ صبح) در این بیمار با کمبود آنزیم ۱۷- آلفا هیدروکسیلاز CYP17A1 (OMIM # 202110, 17- OHD) مطابقت دارد.

17- OHD نوع نادری از CAH است که بروز آن ۱ مورد در هر یک میلیون نوزاد زنده است و به‌صورت اتوزوم مغلوب به ارث می‌رسد. آنزیم CYP17A1 هم فعالیت ۱۷ آلفا- هیدروکسیلازی و هم فعالیت ۱۷ و ۲۰- لیازی دارد. این آنزیم‌ها به ترتیب تبدیل پرگننولون را به ۱۷ آلفا- هیدروکسی پرگننولون و به DHEA و تبدیل پروژسترون را به ۱۷- OHP و به آندروستندیون کاتالیز می‌کنند. شکل ۱، دو نقطه مسدود شدن این مسیر را نشان می‌دهد و یافته‌های سرمی در مقایسه با نتایج مورد انتظار در سه نوع CAH، از جمله دو نوع بسیار شایع کمبود ۲۱- هیدروکسیلاز (فراوانی ۱ در ۱۰ هزار) و کمبود ۱۱ بتا- هیدروکسیلاز (فراوانی ۱ در ۲۰۰ هزار) را فهرست کرده است. به علاوه، دو نوع نادر شامل نقایص در CYP11A1 که کلسترول را به پرگننولون و ۳ بتا- هیدروکسی‌استروئيد دهیدروژناز (HSD3B2) تبدیل می‌کنند، هر دو به دلیل فقدان همزمان مینرالوکورتیکوئيدها و گلوکوکورتیکوئيدها در بحران آدرنال در هنگام تولد نقش دارند.

بیمارانی با ۱۷- OHD کامل، کمبود گلوکوکورتیکوئيد را نشان نمی‌دهند زیرا کورتیکوسترون یک گلوکوکورتیکوئيد ضعیف است. آنها اندام‌های تناسلی زنانه نرمال دارند و مشکلات آنها معمولاً در زمان بلوغ با کندی رشد جنسی ناشی از کمبود آندروژن‌ها و استروژن‌ها، بروز پیدا می‌کند. طی بلوغ نرمال، این استروئيدها شکل‌گیری صفات ثانویه جنسی را تحریک می‌کنند و رشد ناگهانی و متعاقب آن پایان یافتن رشد به دلیل بسته شدن اپی‌فیز را به پیش ‌می‌برند. در غیاب آنها، رشد ممکن است ادامه یابد و به بلندی قد بیش از حد منجر شود که در این بیمار نیز مشاهده شد. در این شرایط، افراد مؤنث فنوتیپیک دچار آمنوره اولیه و مردان XY ۴۶ با نقص نسبی آنزیم، درجاتی از کاهش ظاهر مردانه را نشان می‌دهند که به درجه نقص آنزیمی بستگی دارد. در 17- OHD شدید، ترشح متابولیت کورتیکوسترون در ادرار ۵ برابر مقدار ترشح عادی متابولیت‌های کورتیزول است. این امر نشان‌دهنده پایین‌تر بودن قدرت گلوکوکورتیکوئیدی کورتیکوسترون است: فیدبک مهاری محور هیپوتالاموس- هیپوفیز- آدرنال کاهش یافته است که به افزایش غلظت ACTH و افزایش غلظت سرمی کورتیکوسترون به اندازه‌ای که دقیقاً جایگزین کورتیزول شود، منجر می‌گردد؛ بنابراین این لوپ فیدبکی از طریق یک گونه منفرد از رسپتور گلوکوکورتیکوئيد، خود را تصحیح می‌کند، اگرچه مقادیر افزایش‌یافته ACTH به افزایش غلظت پیش‌ساز کورتیکوسترون یعنی ۱۱- داکسی‌کورتیکوسترون که یک مینرالوکوتیکوئيد ضعیف است منجر می‌شود و موجب افزایش فشارخون و هایپوکالمی می‌گردد.

این اثرات در بیمار ما دیده نشد: ۱۱- داکسی کورتیکواستروئيد افزایش یافته بود اما به مقداری که بر اساس محاسبه ما برای سرکوب کامل سیستم رنین – آنژیوتانسین کافی نبود که با متوقف نشدن فعالیت آنزیم ۱۷ آلفا- هیدروکسیلاز به‌طور کامل، همخوانی دارد. وجود مقدار اندکی از فعالیت آنزیم به‌وسیله غلظت اندک ولو غیرقابل تشخیص کورتیزول و حضور ۱۷- هیدروکسی‌ پروژسترون در سرم بیمار، حمایت می‌شود. غلظت کورتیزول به‌دست‌آمده از آنالیز LC-MS/MS کمتر از غلظت اولیه تعیین‌شده به‌وسیله ایمونواسی بود که یک یافته رایج در CAH به‌شمار می‌آید و این امر نشان‌دهنده واکنش متقاطع ایمونواسی با استروئیدهای مشابه از نظر ساختاری است که ممکن است در غلظت‌های بسیار زیاد وجود داشته باشند. این پدیده به‌ویژه در کمبود بسیار شایع ۲۱- هیدروکسیلاز، به‌طور مشخص مشکل‌ساز می‌شود: کمبودهای شدید عموماً با غلظت‌هایی از کورتیزول همراه هستند که در بازه مرجع قرار می‌گیرد و این مسئله ممکن است به آشفتگی اولیه منجر شود اما به‌وسیله LC-MS/MS مقدار بسیار اندک آن مشخص می‌شود.

یافته‌های اولیه در این بیمار یعنی افزایش غلظت گنادوتروفین‌ها و غلظت نرمال رو به پایین استرادیول‌ نشان‌دهنده اختلال در عملکرد تخمدان بود که در همراهی با مقدار غیرقابل تشخیص آندروژن‌ها، غلظت بالای پروژسترون و کورتیزول ۹ صبح پایین، در وهله اول، تشخیص 17- OHD را مطرح می‌ساخت.

انتظار می‌رفت یافته‌های اولین آنالیز LC-MS/MS مبنی بر بالا بودن غلظت ۱۱- داکسی کورتیزول، در صورت کنار گذاشتن داروهای مهار‌کننده‌ی آنزیم ۱۱ بتا- هیدروکسیلاز (متی‌راپون، آزول ضد قارچ)، وجود کمبود ۱۱ بتا- هیدروکسیلاز (CYP11B1) را نشان دهد. این کمبود به‌طور کلاسیک در دوران نوزادی با اندام‌های جنسی مبهم در زنان بروز می‌یابد و می‌تواند منجر به افزایش فشارخون و هایپرکالمی در هر دو جنس شود. در نوع غیرکلاسیک (خفیف)، زنان اندام‌های تناسلی نرمال دارند اما در بزرگسالی دچار هیرسوتیسم و قاعدگی نامنظم می‌شوند در حالی که مردان به‌جز کوتاهی قد نشانه یا علائم دیگری ندارند. بیماران دچار کمبود ۱۱ بتا- هیدروکسیلاز، علاوه بر سطوح بالای ۱۱- داکسی‌ کورتیزول، دارای سطوح بالای آندروژن‌ها و ۱۷- هیدروکسی پروژسترون نیز می‌باشند. این ویژگی‌های بالینی و بیوشیمیایی در این بیمار وجود نداشت.

با توجه به بالا بودن غیرمنتظره ۱۱- داکسی کورتیزول سرم، پروفایل استروئیدی ادرار بررسی شد. تهیه پروفایل استروئیدی ادراری به‌وسیله GC-MS، تکنیک ارزشمندی برای بررسی اختلالات استروئيدوژنز است، زیرا امکان تشخیص متابولیت‌‌های استروئيدی متعدد را به‌صورت همزمان فراهم می‌آورد. معمولاً مقادیر مربوط به ۲۵ مورد از استروئیدهای حائز اهمیت از نظر کمی، محاسبه می‌شود، اما تقریباً غلظت ۱۰۰ متابولیت در صورت نیاز را می‌توان با این روش به دست آورد. این تکنیک، تشخیص همه نقایص موجود در بیوسنتز استروئیدها را بر اساس الگوی کاهش یا افزایش تولید، ممکن می‌سازد به‌جز کمبود ۱۷ بتا- هیدروکسی‌ استروئيد دهیدروژناز، سیتوکروم b5 و آروماتاز که در کودکان تا زمان بلوغ قابل تشخیص نیستند. الگوی غلظت بالای متابولیت‌های کورتیکوسترون در کنار غلظت پایین متابولیت‌های آندروستندیون، DHEA و کورتیزول در این بیمار، به‌صورت قطعی نشان‌دهنده ۱۷- OHD تقریباً کامل بود.

یافته ناهمخوان ۱۱- داکسی کورتیزول سرم، به‌صورت تداخل isobaric ناشی از کورتیکوسترون تفسیر شد. این استروئيدها به همراه ۲۱- داکسی کورتیزول که یک مارکر مهم CAH ناشی از نقص ۲۱- هیدروکسیلاز است، ایزومر هستند و بنابراین وزن‌های مولکولی یکسانی دارند (شکل ۱)؛ بنابراین تعجب‌آور نخواهد بود که آنها زمان بازداری (retention time) مشابهی در بسیاری از کروماتوگرافی‌های مایع ستونی روتین داشته باشند (شکل ۲) و بنابراین می‌تواند به تداخل ایزوباریک در LC-MS/MS منجر شود.

جداسازی کروماتوگرافیک ۱۱- داکسی کورتیزول و کورتیکوسترون به‌وسیله یک سنجش LC-MS/MS دیگر از استروئيدهای سرم برای برطرف کردن عدم تطابق در این مورد، ضروری بود. این متد برای دربرگرفتن بررسی همه استروئیدهای هدف از جمله کورتیکوسترون و ۱۱- داکسی کورتیزول طراحی شده است. برای دستیابی به این هدف یک برنامه کروماتوگرافی طولانی (کل زمان: 19/7دقیقه) با یک ستون آنالیتیک نسبتاً بلند (mm 2/1 × ۱۰۰) به کار گرفته شد، به علاوه استانداردهای داخلی دوتریوم (deuterated internal standards) برای هر استروئید در پنل، استفاده و mass transitionهای متفاوتی انتخاب گردید که این اقدامات باعث افزایش تمایز بین ایزوبارها شدند. نتایج به‌دست‌آمده از این روش یعنی مقدار ۱۱- داکسی کورتیزول کمتر از حد مرجع و کورتیکوسترون ۱۴ برابر بیشتر از حد بالایی مرجع، از تشخیص 17- OHD حمایت می‌کردند.
۲۱- داکسی کورتیزول نیز غیرقابل تشخیص بود؛ بنابراین تقریباً قطعی به نظر می‌رسد که کورتیکوسترون در اندازه‌گیری ۱۱- داکسی‌ کورتیزول در آنالیز اولیه LC-MS/MS تداخل ایجاد کرده بود.

آگاهی از تداخل ایزوباریک احتمالی در LC-MS/MS بسیار حائز اهمیت است. برخلاف GC-MS، تفکیک‌پذیری در ستون‌های مایع در زمان‌های بازداری نسبتاً کم، دارای تغییرپذیری بیشتری هستند و طیف‌های جرمی بسیار کمتر اختصاصی می‌باشند. در حالی که ممکن است در اکثر مواقع، سیکل‌های زمانی کوتاهی برای آنالیز تعداد محدودی از استروئيدها کافی باشد، تغییرات عمده در متابولیسم استروئيد، آن‌گونه که در انواع مختلف CAH دیده می‌شود، ممکن است منجر به خطا شود. یک راه‌حل عملی برای این مشکل، استفاده از متد کوتاه برای غربالگریCAH  با توان بالا و به دنبال آن برای غربالگری مثبت‌ها، به‌وسیله یک روش آهسته‌تر با تفکیک‌پذیری بیشتر برای تأیید نوع اختصاصی است.

توالی‌یابی ژن CYP با استفاده از آنالیز PCR در این بیمار و به دنبال آن توالی‌یابی اگزون‌ها و مرزهای اینترون- اگزون به روش سنگر، یک واریانت ایجادکنـــنده بیـــــماری همــــوزیگوت شناخته‌شده را نشان داد: g.7604C > A, c.521C > A, P.Ala174Glu و بنابراین تشخیص بیوشیمیایی 17- OHD را تأیید می‌کند.

به‌طور خلاصه ما کیسی از کمبود ۱۷ آلفا- هیدروکسیلاز را شرح دادیم که یک علت نادر آمنوره اولیه است. گزارش اولیه مبنی بر افزایش غلظت سرمی ۱۱- داکسی‌ کورتیزول به‌وسیله LC-MS/MS غیرمنتظره بود و پیگیری‌ها نشان داد که ناشی از تداخل ایزوباریک کورتیکوسترون؛ مارکر استروئيدی که بیشترین افزایش را در این اختلال دارد، بوده است. این مسئله نیاز به بررسی تداخل‌های احتمالی قبل از معرفی و ورود یک متد به عنوان یک سرویس بالینی به آزمایشگاه، هنگام توسعه و اعتبارسنجی آن روش را برجسته می‌سازد. این امر استفاده از یک آنالیز طولانی برای کاربرد ظرفیت-بالا را الزامی نمی‌کند اما آگاهی از محدودیت‌های آنها و در دسترس بودن یک روش پشتیبان تفکیک-بالا توصیه می‌شود.

نکات مهم برای به خاطرسپاری ·        شایع‌ترین انواع CAH کمبود ۲۱- هیدروکسیلاز و ۱۱ بتا- هیدروکسیلاز است. ·   در بررسی اولیه کمبود ۱۷ آلفا- هیدروکسیلاز، ارزیابی‌های استروئیدی به طور معمول در اکثر آزمایشگاه‌های بیمارستان‌های منطقه‌ای (آندروژن‌ها، استروژن‌ها، کورتیزول) غلظت‌های بسیار پایین را نشان می‌دهند، البته به استثناء پروژسترون. ·   ۱۷- هیدروکسی پروژسترون سرمی افزایش‌یافته هم در کمبود ۲۱- هیدروکسیلاز و هم در کمبود ۱۱ بتا- هیدروکسیلاز دیده می‌شود. ·   اختصاصی‌ترین مارکر CAH ناشی از کمبود ۱۷ آلفا- هیدروکسیلاز، ۱۱ بتا- هیدروکسیلاز و ۲۱- هیدروکسیلاز به ترتیب عبارتند از ۱۱- داکسی کورتیزول، کورتیکوسترون و ۲۱- داکسی کورتیزول. این مارکرها ایزوبار هستند. ·   تداخل ایزوباریک در LC-MS/MS زمانی اتفاق می‌افتد که یک ترکیب با ترکیب مورد نظر ما جرم اسمی مشترکی دارد، همان mass transition را ایجاد می‌کند و همراه با آن ترکیب شسته می‌شود. این امر می‌تواند منجر به افزایش کاذب در نتایج شود.

برگردان از:

A Curious Case of Primary Amenorrhea

Clinical Chemistry 66:9 (2020)

منابع:

1. Taylor N. Urinary steroid profiling. Methods Mol Biol 2013;1065:259–76.
2. Taylor DR, Ghataore L, Couchman L, Vincent RP, Whitelaw B, Lewis D, et al. A 13-steroid

serum panel based on LC-MS/MS: Use in detection of adrenocortical carcinoma. Clin

Chem 2017;63:1836–46.

3. Auchus RJ. The genetics, pathophysiology, and management of human deficiencies of

P450c17. Endocrinol Metab Clin North Am 2001;30:101–19.

4. Nimkarn S, New MI. Steroid 11beta- hydroxylase deficiency congenital adrenal hyperplasia.

Trends Endocrinol Metab 2008;19:96–9.

5. Dhir V, Reisch N, Bleicken CM, Lebl J, Kamrath C, Schwarz HP, et al. Steroid 17-hydroxylase

deficiency: functional characterization of four mutations (A174E, V178D, R440C,

L465P) in the CYP17A1 gene. J Clin Endocrinol Metab 2009;94:3058–64.

اثر حاملگی و هورمون‌های جنسی بر نتایج برخی از تست‌های آزمایشگاهی

برای دانلود پی دی اف بر روی لینک زیر کلیک کنید