آسپرجیلوس

بخش پنجم

دکتر محمد قهری

www.ghahri.ir

کلنی آسپرجیلوس نیجر (محیط سابورو دکستروز آگار)

سنجش آنتی‌ژن‌های آسپرجیلوسی

اندازه‌گیری سطح آنتی‌بادی‌ها در میزبان‌هایی که سیستم ایمنی مختل‌شده‌ای دارند و مبتلا به آسپرجیلوزیس تهاجمی شده‌اند اساساً کار مشکلی است؛ بنابراین متدهایی برای تشخیص این عفونت مورد بررسی قرار گرفته‌اند که متکی بر اندازه‌گیری اجزای سلولی قارچی هستند و به این وسیله غیروابسته به توانایی پاسخ‌دهی میزبان می‌باشند.

گالاکتومانان آسپرجیلوسی در طول زمان عفونت در بدن وجود دارد و احتمالاً بعد از پاکسازی به‌وسیله‌ی پروسه‌ی با واسطه رسپتور توسط سلول‌های کوپفر کبدی در ادرار ظاهر می‌شود.

علاوه بر گالاکتومانان حداقل 7 آنتی‌ژن دیگر مرتبط با آسپرجیلوس به‌وسیله‌ی ایمیونوبلاتینگ در ادرار بیماران مبتلا به بیماری تهاجمی سنجش می‌شوند. فرمت‌های مختلف ایمیونواسی برای نشان دادن آنتی‌ژن به‌صورت آزاد یا در کمپلکس‌های ایمنی در سرم و مایع برونکوآلوئلار و یا ادرار طراحی شده‌اند. در دو مورد از بزرگ‌ترین مطالعات در نمونه‌های بیماران، تست رادیوایمون اسی برای سنجش آنتی‌ژن 74 درصد حساسیت و 90 درصد اختصاصیت نشان داده است و هریک از دو روش الایزا که بکار گرفته شدند برای اندازه‌گیری آنتی‌ژنمی (antigenemia) یا آنتی‌ژنوریا (antigenuria) با آنتی‌بادی منوکلونال رت (EB-42) اختصاصی برای گالاکتومانان بیش از 95 درصد حساسیت و اختصاصیت نشان داد. ارزش سنجش گالاکتومانان به‌وسیله تست Pastorex Aspergillus Latex agglutination توسط گروه‌هایی مورد ارزیابی قرار گرفته است (مربوط به کارخانه‌ی Sanofi Diagnostics Pasteur, Marnes-La-Coquette , France) و تست، حساسیت تا 95 درصد با نمونه‌های سرم از بیمارانی که مشکوک به آسپرجیلوزیس تهاجمی بوده‌اند را نشان داده است، همچنین تست لاتکس زودتر از روش‌های میکروبیولوژیک در 68 درصد بیماران آسپرجیلوزیس تهاجمی نتیجه مثبت نشان داد. با این حال این مشاهدات توسط دیگران تأئید نشده و دارای یک حساسیت پائین در حدود 38 درصد بوده است.

در مطالعه‌ی Verweij و همکاران، تست لاتکس نتایج مثبت را در جریان مراحل پیشرفته عفونت در اکثر بیماران مشکوک به آسپرجیلوزیس تهاجمی نشان داد و در تشخیص زودرس سهمی نداشته است، این مطالعه نشان داد که الایزا (Platelia Aspergillus Sanofi Diagnostics Pasteur, Marnes_La_Coquette, France) با استفاده از آنتی‌بادی منوکلونال نسبت به گالاکتومانان، این ماده را در سرم تا 5 روز زودتر نسبت به تست لاتکس شناسایی می‌کند. هر دو تست لاتکس و الایزا قادر به نشان دادن یک عفونت ثابت‌شده نیستند، الایزا گالاکتومانان را در دو بیمار که در آنها تست لاتکس نتایج منفی بدست داده بود آشکار کرد، بعلاوه گالاکتومانان در روش الایزا در نمونه‌های سرم بیشتری نشان داده شد تا به‌وسیله‌ی لاتکس. این مسئله مطرح می‌کند که پایش کردن نمونه‌های سرم پشت سر هم از بیماران در معرض خطر زیاد در طول نوتروپنی ممکن است در مراحل اولیه‌ی عفونت به تشخیص آسپرجیلوزیس تهاجمی کمک کند. علاوه بر این، گالاکتومانان به‌وسیله‌ی الایزا در مایع برونکوآلوئلار لاواژ نشان داده شده است، اما آنتی‌ژن ممکن است در سرم زودتر ظاهر شود.

نتایج مثبت کاذب مشکلاتی هستند که با افزایش حساسیت روش‌های ایمیونواسی مثل الایزا و لاتکس آگلوتیناسیون ارتباط دارند، بنابراین برای تأئید یک افزایش واقعی در سطح آنتی‌ژن در سرم، نتایج مثبت الایزا باید حداقل برای دو نمونه سرم پشت سر هم بدست آید. مطالعاتی که توسط Verweij و همکاران انجام شده دلگرم‌کننده هستند و پایه‌ای را برای یکسری توصیه‌ها برای تشخیص ایمیونولوژیک (ایمیونودیاگنوزیس) آسپرجیلوزیس تهاجمی تشکیل داده‌اند:

آزمایش آنتی‌ژن در سرم در فواصل منظم به‌وسیله‌ی تکنیک الایزا ساندویچ (double sandwich ELISA) به تشخیص زودرس آسپرجیلوزیس تهاجمی در بیمارانِ دارای اختلال در سیستم ایمنی (ایمیونوکامپرومایزد) کمک می‌کند.
جمع‌آوری دو بار در هفته و تست نمونه‌های سرم از بیمار در جریان دوره‌های نوتروپنی برای نشان دادن افزایش در سطح سرمی گالاکتومانان در اوایل دوره‌ی عفونت باید کافی باشد.
در جایی که یک نتیجه‌ی مثبت در تست الایزا داریم، برای اینکه احتمال نتیجه مثبت کاذب رد شود نمونه‌های سرم دیگری باید تست شوند.
آسپرجیلوزیس تهاجمی مشکوک باید به‌وسیله‌ی رادیوگرافی از قفسه‌ی سینه، CT و یا BAL مورد تأئید قرار گیرد.

ساندویچ الایزا برای نشان دادن گالاکتومانان در حال حاضر حساس‌ترین روش موجود است. مطالعات متعددی در اروپا انجام شده و نشان داده شده است که ساندویچ الایزا در تشخیص زودهنگام آسپرجیلوزیس تهاجمی سهم خوبی ایفا می‌کند و قابلیت تکرار درون آزمایشگاهی و بین آزمایشگاهی این روش به‌طور معقولی خوب است. بنظر می‌رسد که گالاکتومانان در تمام نمونه‌ها متعاقب کسب اولین نمونه‌ی مثبت در جریان بیماری در یک بیمار موردنظر نشان داده می‌شود. اگرچه دانسته شده است که بالاترین غلظت گالاکتومانان همیشه در فازهای انتهایی بیماری پخش و منتشر (released) می‌شوند، فارماکوکینتیک آنتی‌ژن در مدل‌های حیوانی یا در انسان‌ها به اندازه کافی مورد مطالعه قرار گرفته نشده است. بسته به بیمار، آنتی‌ژنمی مثبت می‌تواند از 1 هفته تا 2 ماه باقی بماند. باید تأکید شود که نتیجه‌ی منفی آنتی‌ژن احتمال و امکان بیماری را نفی نمی‌کند. علاوه بر این، تلاش بیشتری در جستجوی آنتی‌ژن‌های immunodominant باید انجام شود. مطالعات جدید نشان داده‌اند که آسپرجیلوزیس تهاجمی در صورتی که در این مرحله تشخیص داده شود با کمک آمفوتریسین B قابل درمان است. سودمندیِ دیگر تست الایزا این است که تیترهای آنتی‌ژن را در سرم در جریان درمان می‌توان مورد پایش قرار داد. یک کاهش در غلظت گالاکتومانان در سرم نشان‌دهنده‌ی پاسخ به درمان است. آنتی‌ژنمی و آنتی‌ژنوریا هر دو گذرا هستند. اگرچه اکنون روش‌های بسیار حساس فراهم هستند و اجازه می‌دهند که سطوح پائین آنتی‌بادی در نمونه‌های سرم بررسی شوند، به‌عنوان مثال به‌وسیله‌ی ایزوالکتریک فوکوسینگ آنالیتیکال به همراه ایمیونوبلاتینگ، 11 مورد از 13 بیمار با موارد احتمالی (probable) یا اثبات‌شده (proven)ی آسپرجیلوزیس تهاجمی، آنتی‌بادی کلاس IgG آسپرجیلوسی نسبت به نمونه‌های آنتی‌ژنی آسپرجیلوس فومیگاتوس داشتند. این مطالعه نشان می‌دهد که این نوع تکنیک بسیار حساس و اختصاصی برای آسپرجیلوزیس تهاجمی است، همچنین نشان می‌دهد که با توجه به تنوعی که در پاسخ‌های ایمنی افراد دیده می‌شود استفاده از یک طیف از فراکشن‌های آنتی‌ژنیک معقول است.

راه دیگر برای تشخیص آسپرجیلوزیس که مستقل از پاسخ ایمیونولوژیک میزبان باشد، سنجش (آزمایش) متابولیت‌های قارچی در مایعات بدن بیماران است. سطوح بالای دی- مانیتول (D-mannitol) در سرم و بافت‌ها در حیواناتی که به‌صورت تجربی عفونی شده‌اند نشان داده است که با حضور و وسعت عفونت آسپرجیلوسی (IA) همبستگی دارند. همچنین حضور اسید اگزالیک در مایع برونکوآلوئلار لاواژ به‌عنوان یک مارکر فرضی (احتمالی) برای آسپرجیلوزیس در نظر گرفته می‌شود.

مناظر ماکروسکپی (کشت) و میکروسکپی از آسپرجیلوس نیجر

آسپرجیلوس نیجر اغلب اوقات عامل مسبب در توپ قارچی است و ممکن است مقادیر فراوانی اسیداگزالیک به داخل توپ قارچی و یا حفره اطراف آن تولید کند. درواقع کریستال‌های اگزالات کلسیم ممکن است علامتی از عفونت با آسپرجیلوس نیجر باشد. خونریزی موضعی به علت اروزیون ناشی از توپ قارچی در دیواره حفره یا به علت وجود بیماری زمینه‌ای حفره‌داری مانند سارکوئیدوز ایجاد می‌شود. آسپرجیلومای مجاری تنفسی در اغلب اوقات یک فرآیند پوشیده و مخفی کلینیکی است تا زمانی که بیمار از هموپتیزی شکایت کند، همچنین آسپرجیلوما ممکن است در طی پیگیری روتین بیماران دارای توبرکلوز و یا سارکوئیدوز حفره‌دار کشف و پیدا شود. شکل و نمای رادیولوژیک ناحیه چگال کاملاً گرد داخل یک حفره که تا حدودی به‌وسیله هاله هلالی شکل شفاف (رادیولوسنت) وجه مشخصه آسپرجیلوما است، هرچند که قارچ‌های رشته‌ای غیر از آسپرجیلوس از قبیل سودوآلشریا بویدی‌ای و زیگومیست‌ها نیز می‌توانند توپ‌های قارچی داخل حفره‌ای ایجاد نموده و منظره آسپرجیلوما را شبیه‌سازی کنند.

کلنی‌های آسپرجیلوس فومیگاتوس

کونیدیوفور و وزیکول‌های بارور آسپرجیلوس فومیگاتوس

G- Test

دیواره‌ی سلولی هایفای آسپرجیلوس و دیواره‌های سلولی سایر قارچ‌های پاتوژنیک از انواع مانان و گلوکان‌ها تشکیل شده‌اند. آزمایش 1,3-ẞ-D-glucan موجود در جریان خون یک استراتژی جستجوگرایانه (investigative) برای تشخیص آسپرجیلوزیس تهاجمی است. غلظت پلاسمایی 1,3-ẞ-D-glucan در زمانی که کشت‌های روتین انجام می‌گیرد در رخدادهای تب‌دار اندازه‌گیری شده است. با یک کات‌آف پلاسمایی 20pg/ml، 37 از 41 رخداد از عفونت‌های قارچی اثبات شده (که در اتوپسی یا به‌وسیله‌ی روش‌های میکروبیولوژیک تأئید شده بودند) شامل آسپرجیلوزیس تهاجمی نشان داده شده بود. تمام 59 رخداد عفونت‌های غیرقارچی، تب مربوط به تومور، یا بیماری‌های کلاژن– واسکولار غلظت‌های زیر کات‌آف داشتند (اختصاصیت 100%).

از 102 رخداد تب با علت ناشناخته، 26 بیمار غلظت‌های گلوکان بیش از کات‌آف (20pg/ml) داشته‌اند. از این 102 مورد که به‌عنوان عفونت‌های غیرقارچی گرفته شدند، ارزش پیشگویی‌کننده‌ی مثبت تست 59% تخمین زده شد (37 از 63)، ارزش پیشگویی منفی 97% (135 از 139) و کارآمدی (efficacy) معادل 85% (172 از 202) تخمین زده شد. اگرچه یک نتیجه‌ی مثبت علت اختصاصی عفونت قارچی مهاجم را نشان نمی‌دهد، اما این روش دلگرم‌کننده است و جستجوی وسیع‌تری را در جمعیـــــــــت‌های انتخاب‌شده بیماران توجیه می‌کند. این آزمایش اکنون به‌صورت تجارتی در دسترس قرار گرفتـــــــه است، هرچند که قیمت گزاف آن استفاده از آن را در سطح آزمایشگاه‌های رفرانس محدود ســـــــــاخته است (Fungitec G- Test, Seikagaku, Japan; AMS Biotechnology {Europe} Ltd, UK)