تولید پلاستیک زیستی (پلیهیدروکسی آلکانوات)
به‌وسیله میکروارگانیسم‌ها (قسمت سوم)
وهاب پیرانفر (کارشناس ارشد)، محمد عرفانی (کارشناس ارشد)، دکتر رضا میرنژاد (دانشیار دانشگاه)
در قسمت‌های قبل در خصوص پلاستیک زیستی (پلیهیدروکسی آلکانوات) ازجمله ساختار، ویژگی‌ها، خصوصیات فیزیکی و راه‌های سنتز این ماده مطالبی ارائه شد که در این بخش به نمونه‌هایی از تولید آن توسط میکروارگانیسم‌های مختلف اشاره‌ای کوتاه می‌گردد.
تولید پلیهیدروکسی آلکانوات به‌وسیله باکتری رالستونیا اتروفا
رالستونیا اتروفا به خاطر توانایی‌اش در خصوص ذخیره پلیهیدروکسی بوتیرات از منبع کربن ساده مثل گلوکز، فروکتوز[1] و اسید استیک موردمطالعه بسیار قرار گرفته است. انستیتو عالی شیمی انگلستان[2] تولید پلیهیدروکسی بوتیرات از گلوکز و پلی 3-هیدروکسی بوتیرات-کو-3-هیدروکسی والرات از مخلوط گلوکز و اسید پروپیونیک را در مقیاس بزرگ به‌وسیله کشت فید-بچ[3] باکتری رالستونیا اتروفا انجام داده است. در این مطالعه سلول‌ها ابتدا بر روی محیط گلوکز- نمک حاوی مقدار مشخصی از فسفات برای رشد مطلوب سلول‌ها، کشت داده شدند. سلول‌ها بعد از ۶۰ ساعت رشد با محدودیت فسفات روبرو می‌شوند و طی ۴۰ تا ۶۰ ساعت آینده به ذخیره‌سازی پلیهیدروکسی بوتیرات از منبع گلوکز می‌پــــردازند. به‌وسیله کنترل غلظت گلوکز در 20- 10 گرم بر لیتر در طی کشت فید-بچ، جرم سلول‌های نهایی، غلظت پلیهیدروکسی بوتیرات و مقدار پلیهیدروکسی بوتیرات به ترتیب ۱۶۴ گرم بر لیتر، ۱۲۱ گرم بر لیتر و ۷۶ گرم بر لیتر در ۵۰ ساعت بدست آمد.
در این سال‌ها چندین منبع کربن دیگر نیز غیر از گلوکز به‌عنوان سوبسترای تولید پلیهیدروکسی آلکانوات در رالستونیا اتروفا مورد استفاده قرار گرفتند. در یک مطالعه مشخص شد که هنگامی که این باکتری توسط اسید لاکتیک به‌عنوان منبع کربن به‌صورت دوره‌ای تغذیه شود، مقدار پلیهیدروکسی بوتیرات حاصله به میزان قابل‌ملاحظه‌ای افزایش می‌یابد، درحالی‌که وقتی به‌وسیله سیستم کشت دومرحله‌ای فید-بچ تغذیه گردد، پلیهیدروکسی بوتیرات بدست آمده چیزی حدود ۵۹ گرم بر لیتر است. البته تولید پلیهیدروکسی بوتیرات با استفاده از کشت بچ باکتری رالستونیا اتروفا ATCC 17699 با منبع کربن اسید استیک نیز موردمطالعه قرار گرفته است.
در پژوهشی که در سال 2005 توسط Shilpi and Ashok انجام گردید تولید مداوم پلیهیدروکسی بوتیرات به‌وسیله باکتری رالستونیا اتروفا WSH3 در سیستم کشت دومرحله‌ای به اثبات رسید؛ در اولین مرحله کشت بر روی گلوکز حداکثر وزن خشک سلول به مقدار 27/1 گرم بر لیتر در مقدار رقت 0.21 h-1 مشاهده شد، درحالی‌که در مرحله دوم پلیهیدروکسی بوتیرات ذخیره شده 47/6 گرم بر لیتر و در مقدار رقت 0.14 h-1 ثبت گردید.
همچنین گزارش شده که باکتری رالستونیا اتروفا می‌تواند در شرایط اتوتروف[4] از دی‌اکسید کربن استفاده کند. امروزه روغن گیاهی نیز به‌عنوان یک سوبسترای عالی موردتوجه قرار گرفته است و تولید 5/32 گرم بر لیتر از پلیهیدروکسی بوتیرات به‌وسیله کشت فید-بچ باکتری رالستونیا اتروفا با منبع کربن اولئیک اسید[5] در ۶۰ ساعت گزارش شده است. همچنین از باکتری رالستونیا اتروفا DSM 11348 در تولید پلیهیدروکسی بوتیرات با استفاده از محیط حاوی گلیسرول و کازئین هیدرولیزات[6] به‌عنوان منبع کربن و نیتروژن استفاده شده است. علاوه بر منابع کربن ذکر شده رالستونیا اتروفا می‌تواند از منابع کربن ویژه‌ای نیز مانند 4-هیدروکسی بوتیریک اسید، γ-بوتیرولاکتون[7] و ۱ و 4-بوتاندیول[8] استفاده کند و مونومرهای 4-هیدروکسی بوتیرات به همراه
3-هیدروکسی بوتیرات تولید نماید. در این حین در یک مطالعه آزمایشگاهی مشخص شد که اسیدهای چرب با زنجیره متوسط مثل نونانوئیک اسید[9] و اکتانوئیک اسید[10] برای رالستونیا اتروفا نسبت به اسیدهای چرب زنجیره کوتاه مثل استیک اسید، پروپیونیک اسید و بوتریک اسید، بسیار سمی هستند.
استفاده از n-آلکانوات زوج سبب تولید هوموپلیمرهای پلیهیدروکسی بوتیرات و n-آلکانوات فرد سبب تولید کوپلیمرهای 3-هیدروکسی بوتیرات و 3-هیدروکسی والرات می‌شود. همچنین در مطالعه‌ای سویه نوترکیب شده رالستونیا اتروفا با ژن پلیهیدروکسی آلکانوات سنتئاز باکتری ائروموناس کاویا با استفاده از n-آلکانوات فرد، تری‌پلیمر پلی 3-هیدروکسی بوتیرات-کو-3-هیدروکسی والرات-کو-3-هگزانوات را تولید کردند. این سویه نیز با استفاده از روغن سویا به‌عنوان منبع کربن، قدرت تولید پلی 3-هیدروکسی بوتیرات-کو -3-هیدروکسی هگزانوات را در مقیاس بزرگ دارد. مطالعات نشان داده که باکتری رالستونیا اتروفا H16 افزایش تولید داشت و کوپلیمرهای آن در شرایط رشد اکسیداتیو، پلی 3-هیدروکسی بوتیرات-کو-3-هیدروکسی والرات می‌باشد.
باکتری رالستونیا اتروفا H16 و باکتری سودوموناس اولئوورانس نیز قادر به استفاده از روغن ته‌نشین شده از تولید رامانوز[11] به‌عنوان منبع کربن برای رشد و ذخیره‌سازی پلیهیدروکسی آلکانوات هستند. تقریباً ۲۰ تا ۲۵ درصد از ترکیبات روغن ته‌نشین تبدیل به پلیهیدروکسی بوتیرات می‌شود. بازده هر یک از این باکتری‌ها رالستونیا اتروفا H16 و سودوموناس اولئوورانس در این فرآیند به ترتیب 41/3 درصد و 38/9 درصد از وزن خشک سلولی بود.
در اغلب اوقات تولید پلیهیدروکسی بوتیرات به‌وسیله باکتری رالستونیا اتروفا ATCC 17697 از مخلوط L-لاکتیک اسید و استیک اسید صورت می‌گیرد. غلظت اسید لاکتیک، اسید استیک و افزایش pH در محیط کشت به‌عنوان شاخص کنترل غذایی، کنترل و غلظت سلولی و مقدار پلیهیدروکسی بوتیرات بعد از ۴۲ ساعت به ترتیب ۷۵ گرم بر لیتر و 73/1 درصد گزارش گردید. همچنین پلیهیدروکسی با استفاده از کشت ترکیبی تولید شده است؛ در این حالت قندهایی مثل گلوکز به‌وسیله لاکتو باسیلوس دلبروکی[12] IAM 1928 به اسید لاکتیک تبدیل می‌شود و اسید لاکتیک حاصله به‌وسیله باکتری رالستونیا اتروفا H16 در یک فرآیند تخمیری مشابه به پلیهیدروکسی بوتیریک تبدیل می‌شود. تاکنون تعداد کمی مدل ریاضی برای بیوسنتز پلیهیدروکسی بوتیرات ارائه شده که بتواند رفتار دینامیکی تولید پلیهیدروکسی بوتیرات را در محیط کشت ترکیبی را بیان کند. این مدل‌ها دارای چندین شاخص مثل کنترل، بهینه‌سازی و درک روند دینامیکی به‌خصوص در شرایط کشت ترکیبی هستند.
پلیهیدروکسی بوتیرات به‌شدت سخت، کریستالی و نسبتاً شکننده است. دمای ذوب آن ۱۷۵ درجه سلسیوس است که تنها کمی کمتر از دمای تجزیه به اسید کروتونیک[13] (۱۸۵ درجه سلسیوس) می‌باشد و این مسئله روند ساخت را با مشکل روبرو می‌کند. با توجه به خواص فیزیکی نسبتاً ضعیف هوموپلیمر پلیهیدروکسی بوتیرات، تلاش گسترده‌ای جهت ساخت کوپلیمرهایی که خواص فیزیکی بهتری دارند، انجام شده است. تلفیق مونومرهای ۳ یا ۵ کربنه به پلیمرهای دارای پایه 3-هیدروکسی بوتیرات سبب کاهش تبلور و نقطه ذوب در مقایسه با هوموپلیمر پلیهیدروکسی بوتیرات می‌شود؛ به‌عنوان مثال با اضافه کردن پروپیونیک اسید و والریک اسید به محیط کشت حاوی گلوکز سبب تولید کوپلیمر پلی 3-هیدروکسی بوتیرات-کو-هیدروکسی والرات می‌شود. همچنین تولید پلی 3-هیدروکسی بوتیرات-کو-3-هیدروکسی والرات به‌وسیله کشت بچ گونه رالستونیا اتروفا سویه GC-64 از روغن دانه پنبه و والریک اسید نیز گزارش شده است.
تولید پلیهیدروکسی آلکانوات به‌وسیله باکتری آلکانیژنز لاتوس
باکتری آلکانیژنز لاتوس پلیهیدروکسی بوتیرات را با استفاده از منابع کربن ارزان مانند گلوکز و ساکاروز در مقیاس قابل‌ملاحظه‌ای نسبت به باکتری رالستونیا اتروفا H۱۶ تولید می‌کند. آلکانیژنز لاتوس ۱۱۲۳ DSM قادر به رشد در دمای ۳۵ درجه سلسیوس می‌باشد. این سویه تنها نیاز به ۵ ساعت دارد تا غلظت پلیهیدروکسی بوتیرات داخل سلولی را به ۸۰ درصد از وزن خشک سلول برساند. غلظت پلیهیدروکسی بوتیرات در این سویه از ۵۰ درصد به ۸۷ درصد در کشت فید-بچ به‌واسطه القاء محدودیت نیتروژن، افزایش پیدا می‌کند. سویه‌هایی از آلکانیژنز لاتوس برای تولید پلیهیدروکسی بوتیرات می‌توانند از مالاز یا شربت قند استفاده کنند. کشت فید-بتچ باکتری آلکانیژنز لاتوس 29713 ATCC بعد از ۹۳ ساعت تولیدی بالغ بر ۶۳ درصد از وزن خشک سلولی را ارائه می‌کند. چهار منبع نیتروژن- آمونیوم کلراید، آمونیوم سولفات، آمونیوم نیترات و اوره- در رابطه با این باکتری استفاده شده است که تنها دو منبع اول از رشد کشت و تولید پلیهیدروکسی بوتیرات حمایت می‌کنند.
تولید پلیهیدروکسی آلکانوات به‌وسیله متیلوتروف‌ها
هزینه تولید پلاستیک‌های زیست‌تخریب‌پذیر ممکن است با استفاده از متانول به‌عنوان سوبسترای رشد و تولید پلیهیدروکسی بوتیرات، کاهش یابد. مطالعات تخمیری با استفاده از باکتری متیلوباکتریوم اکستورکونس[14] در فرمانتور، در حالت فید-بچ ناپیوسته برای جمع‌آوری متانول صورت گرفته است. استفاده از متیلوتروف‌ها توسط صنایع شیمیایی سلطنتی انگلستان برای تولید پلیهیدروکسی بوتیرات از متانول که یک منبع کربن ارزان بود، مطرح شد؛ ولی ذخیره‌سازی پلیهیدروکسی بوتیرات کمتر از حد رضایت‌بخش بود و این مسئله فرآیند استخراج را دشوار می‌نمود؛ بنابراین شرکت این فرآیند را کنار گذاشت، اما غلظت بالای (۱۴۹ گرم در لیتر) پلیهیدروکسی بوتیرات به‌وسیله کشت فید-بتچ کاملاً اتوماتیک توسط باکتری متیلوباکتریوم اکستورکونس با استفاده از متانول به‌عنوان منبع کربن بعد از ۱۷۰ ساعت بدست آمد. بدین طریق سود تولید پلیهیدروکسی بوتیرات از متانول ارزان می‌تواند حداقل تا دو برابر افزایش پیدا کند.
تولید پلیهیدروکسی آلکانوات به‌وسیله گونه‌های سودوموناس
تولید پلیهیدروکسی آلکانوات زنجیره متوسط به‌وسیله کشت فید-بچ و کشت متوالی از سودوموناس اولئوورانس برای بدست آوردن غلظت بالایی از پلیهیدروکسی آلکانوات با بهره‌وری زیاد، موردمطالعه قرار گرفته است. با بهینه‌سازی حالت‌های کشت به‌صورت پایدار، غلظت سلولی و بهره‌وری به ترتیب 11/6 گرم بر لیتر و 0/58 گرم بر ساعت حاصل شده است. باکتری سودوموناس اولئوورانس NRRL B-778 به هنگام رشد بر روی محیط حاوی گلوکز و اکتانوئیک اسید، مخلوطی از پلیهیدروکسی بوتیرات و پلیهیدروکسی آلکانوات زنجیره متوسط را تولید می‌کند، درحالی‌که با رشد بر روی محیط حاوی نونانوئیک اسید، کوپلیمر پلی 3-هیدروکسی بوتیرات-کو-3-هیدروکسی والرات حاصل می‌گردد. در مطالعه‌ای باکتری سودوموناس اولئوورانس که بر روی محیط حاوی n-آلکانوئیک اسید (از فورمات[15] تا دکانوات) به‌عنوان منبع کربن رشد داده شده، از لحاظ ایجاد و شکل‌گیری پلیهیدروکسی آلکانوات داخل سلولی مورد بررسی قرار گرفت؛ و مشخص گردید که تنها n-آلکانوئیک اسیدهایی که بزرگ‌تر از هگزانوات بودند سبب تشکیل پلیهیدروکسی آلکانوات می‌گردند. باکتری‌های سودوموناس اشتوزری[16] ۱۳۱۷ ATCC به هنگام رشد بر روی گلوکز و اسید چرب، پلیهیدروکسی آلکانوات‌های مختلفی را سنتز می‌کنند. این مسئله نشان می‌دهد که ساختار مونومریک پلیهیدروکسی آلکانوات‌ها وابسته به ساختار اسیدهای چربی هستند که به‌عنوان منبع کربن مورد استفاده قرار می‌گیرند.
ژن‌های استواستیل ردوکتاز و پلیهیدروکسی آلکانوات سنتئاز باکتری رالستونیا اتروفا در باکتری‌های اشریشیاکلی و سودوموناس پوتیدا بیان شده است. مطالعات نشان می‌دهد که سویه اشریشیاکلی هنگامی که بر روی اسید چرب به‌عنوان سوبسترای کربنی رشد می‌کنند موفق به ذخیره‌سازی پلیهیدروکسی بوتیرات می‌شوند، اما باکتری سودوموناس پوتیدا به هنگام رشد بر روی اسیدهای چرب زنجیره زوج، پلی 3-هیدروکسی بوتیرات-کو-3-هیدروکسی هگزانوات تولید می‌نمایند، درحالی‌که همین باکتری با استفاده از اسیدهای چرب زنجیره فرد موفق به تولید پلی 3-هیدروکسی بوتیرات-کو-3-هیدروکسی والرات می‌گردد.
[1] Fructose
[2] Imperial Chemical Industries (ICI)
[3] Fed-batch
[4] Autotrophic
[5] Oleic acid
[6] Casein hydrolysate
[7] γ-butyrolactone
[8] 1,4-butanediol
[9] Nonanoic
[10] Octanoic
[11] Rhamnose
[12] Lactobacillus delbruecki
[13] Crotonic acid
[14] Methylobacterium extorquens
[15] Formate
[16] Pseudomonas stutzeri
تولید پلاستیک زیستی (پلیهیدروکسی آلکانوات) به‌وسیله میکروارگانیسم‌ها (1)
تولید پلاستیک زیستی (پلیهیدروکسی آلکانوات) به‌وسیله میکروارگانیسم‌ها (2)
برای دانلود فایل pdf بر روی لینک زیر کلیک کنید
ورود / ثبت نام