تکنیک‌های بررسی برهمکنش‌های پروتئین- پروتئین در تحقیقات پروتئومیکس
محسن قریانی
دانشجوی دکترای تخصصی (Ph.D) ایمونولوژی پزشکی
پژوهشکده بوعلی – مرکز تحقیقات ایمونولوژی
دانشگاه علوم پزشکی مشهد
پروتئومیکس، علم مطالعه پروتئین‌ها در مقیاس وسیع است. اهداف اصلی این علم شامل شناسایی پروتئین‌ها، مطالعه تغییرات پس از ترجمه آنها و بررسی عملکرد و برهمکنش‌های آنها در شرایط فیزیولوژیک یا پاتولوژیک مختلف می‌باشد.
بسیاری از پروتئین‌ها در ارتباط با سایر پروتئین‌ها اعمال خود را انجام می‌دهند و یکی از اهداف پروتئومیکس، شناسایی پروتئین‌هایی است که با یکدیگر برهمکنش دارند. این برهمکنش‌ها در ایجاد سیگنال‌های سلولی و نیز پیش‌بینی آنها نقشی مهم دارند. در این مقاله به معرفی تکنیک‌های رایج در بررسی برهمکنش‌های پروتئین- پروتئین پرداخته می‌شود.
سیستم دو هیبرید
سیستم دو هیبرید یکی از رایج‌ترین روش‌ها برای بررسی یا تأیید برهمکنش بین پروتئین‌ها می‌باشد و سیستمی است که واکنش بین دو پروتئین را بوسیله ساخت مجدد یک عامل رونویسی فعال در شرایط آزمایشگاهی تعیین می‌کند. بیشتر عوامل رونویسی یوکاریوتی دومین‌های فعال کننده رونویسی و اتصال به DNA دارند. فعال کردن رونویسی ممکن است بوسیله بیان مستقل دو زنجیره بصورت ترکیبات کایمری با پروتئین‌هایی که داخل بدن با هم واکنش می‌دهند، صورت گیرد. یک کایمر دارای زنجیره اتصال به DNA ترکیب شده با اولین پروتئین مورد نظر (طعمه) و کایمر دیگر دارای یک زنجیره فعال کننده پروتئین دوم (پروتئین هدف) است. واکنش بین این دو پروتئین به ساخت عوامل رونویسی و در نهایت فعال شدن ژن گزارشگر منجر می‌شود. شاخص انتخاب موجود در سیستم، رونویسی ژن و برهمکنش دو پروتئین را تأیید می‌کند.
تشدید سطحی پلاسمون (SPR[1])
با طراحی افینیتی بیوسنسورهایی مبتنی بر تشدید سطحی پلاسمون می‌توان برهمکنش بین مولکول‌های پروتئینی ایموبیلایز شده در سطح سنسور و مولکول‌های موجود در محلول را شناسایی کرد. اصول این روش به این شرح است: در قسمت اپتیک سنسور SPR، طول موجی خاص، میدانی الکترومغناطیسی در سطح پلاسمون ایجاد می‌کند. پلاسمون در امتداد فیلمی نازک از جنس فلز پخش شده است. پروتئین موردنظر در سطح سنسور قرار داده می‌شود و طول موجی مشخص به سطح آن تابانده می‌شود و ضریب شکست آن ثبت می‌گردد. سپس محلول حاوی پروتئین دوم به سنسور اضافه می‌گردد و همان طول موج دوباره به سنسور تابانده می‌شود. چنانچه دو پروتئین با یکدیگر برهمکنش داشته باشند میزان ضریب شکست افزایش می‌یابد، در غیر این صورت میزان ضریب شکست با حالت قبل مساوی است.
روش TAP-tagging
این روش بر مبنای برچسب زدن دوگانه پروتئین‌ها در جایگاه کروموزومی آنها و سپس دو مرحله فرایند تخلیص است. پروتئین‌هایی که در ارتباط با پروتئین هدف باقی می‌مانند می‌توانند مورد بررسی و شناسایی توسط SDS-PAGE و سپس طیف‌سنجی جرمی قرار بگیرند. ویژگی اصلی این روش، توانایی آن در شناسایی محدوده وسیعی از کمپلکس‌های پروتئینی است و زمانی که با طیف‌سنجی جرمی ترکیب شود می‌تواند میانکنش‌های پروتئینی را نیز آشکار سازد.
افینیتی کروماتوگرافی
در این روش از واکنش‌های افینیتی بین پروتئین هدف و پروتئینی که با آن برهمکنش دارد استفاده می‌شود. مزیت این روش این است که می‌تواند حتی ضعیف‌ترین برهمکنش‌ها بین پروتئین‌ها را شناسایی کند و نیز توانایی آشکار‌سازی برهمکنش بین تمام پروتئین‌های موجود در ستون با پروتئین هدف را دارد.
Protein-fragment complementation assay (PCAs)
با روش PCAs می‌توان برهمکنش‌های پروتئین- پروتئین را در سلـول زنده، ارگانیسم‌های چند سلولی یا مطالــــعات in vitro بررسی کرد. این روش توانایی شناسایی برهمکنش بین پروتئین‌ها با هر وزن مولکولی را دارد. در این روش از هر پروتئینی که قابلیت شکستن به دو قسمت را داشته باشد و نیز بتواند دوباره از طریق واکنش‌های غیرکووالان به حالت اول برگردد، می‌توان استفاده کرد. برای اتصال مجدد این دو بخش، از مولکول‌های متصل شونده به آنها که با یکدیگر برهمکنش دارند (یا هدف ما بررسی برهمکنش میان آنها است) استفاده می‌شود. در این سیستم از گزارشگر‌هایی مثل آنزیم‌های مقاومت به آنتی‌بیوتیک‌ها یا سیگنال‌های فلوسنت استفاده می‌شود که می‌توانند برهمکنش دو پروتئین اتصالی به آنها را آشکار سازند.
نمایش فاژی[2]
در این روش معمولاً از فاژ M13 استفاده می‌شود. DNAای که پروتئین موردنظر را کد می‌کند به یکی از ژن‌هایی که پروتئین پوشش فاژ را کد می‌کند، متصل می‌شود. در ادامه با آنالیز‌های کامپیوتری، پروتئین‌هایی که امکان برهمکنش با پروتئین بیان شده در سطح فاژ را دارند، مشخص می‌شوند و می‌توان با استفاده از سیستم‌های دو هیبریدی مخمر، میانکنش بین پروتئین‌ها را تأیید نمود.
کریستالوگرافی اشعه X
با کریستالوگرافی اشعه X بررسی ساختار پروتئین‌ها در سطح اتمی امکان‌پذیر می‌شود و این روش نشان می‌دهد که پروتئین‌ها چگونه با سایر مولکول‌ها برهمکنش ایجاد می‌کنند، همچنین با این روش می‌توان تغییرات ساختاری آنزیم‌ها را در واکنش مورد بررسی قرار داد.
روش‌های وابسته به کامپیوتر در پیش‌بینی برهمکنش‌های پروتئین- پروتئین
تکنیک‌های دو هیبرید مخمری و سایر روش‌های شناسایی برهمکنش‌های پروتئین- پروتئین داده‌هایی را می‌دهند که ممکن است خیلی قابل اعتماد نباشند؛ زیرا در این روش‌ها تمام برهمکنش‌های ممکن بین پروتئین‌ها بررسی نمی‌شوند. برای شناسایی تمام برهمکنش‌های ممکن بین پروتئین‌ها از روش‌های کامپیوتری یا in silico استفاده می‌شود که قابلیت پیش‌بینی تمام برهمکنش‌های ممکن بین پروتئین‌ها را فراهم می‌سازند که در ادامه معرفی می‌گردند.
روش‌های پیش‌بینی مبتنی بر ساختار
در این روش برهمکنش‌های پروتئین- پروتئین، بین دو پروتئینی که ساختار مشابه دارند، پیش‌بینی می‌شود. در مورد پروتئین‌هایی که ساختار آنها ناشناخته است، اولین قدم، حدس ساختار آنها بر اساس توالی آنها است. به این منظور از بانک‌های اطلاعاتی پروتئین‌ها(PBDs[3]) استفاده می‌شود.
روش‌های پیش‌بینی مبتنی بر توالی
پیش‌بینی برهمکنش‌های پروتئین- پروتئین از طریق ترکیب شواهد مربوط به برهمکنش‌های شناخته شده و اطلاعات مربوط به تشابه توالی، امکان‌پذیر است. این روش مبتنی بر این اصل است که برهمکنش‌هایی که در یک گونه یافت می‌شوند، قابل انتساب به گونه‌های دیگر نیز می‌توانند باشند. بر این اساس از اطلاعات مربوط به توالی پروتئین‌ها برای دسته‌بندی آنها در گروه‌هایی که با هم برهمکنش دارند یا ندارند، استفاده می‌شود.
مجاورت کروموزومی/ همسایگی ژنی
تحقیقات نشان می‌دهند که ژن‌های کد کننده پروتئین‌هایی با عملکرد مرتبط، معمولاً در جایگاه‌های ژنی نزدیک بهم قرار دارند. از این اصل برای مطالعه ارتباطات عملکردی پروتئین‌ها استفاده می‌شود. همچنین مطالعات اخیر نشان می‌دهند که بین ژن‌های مجاور، ارتباطی عملکردی وجود دارد و در بعضی از موارد، یکی از دو ژن مجاور، پروتئین‌های تنظیمی رونویسی و دیگری پروتئین‌های غیرتنظیمی را کد می‌کند.
فیوژن ژنی
این روش به روشRosetta Stone نیز معروف است و بر این اصل است که در یک ارگانیسم بعضی از پروتئین‌هایی که یک دومین منفرد دارند می‌توانند از طریق فیوژن در سایر ارگانیسم‌ها، ایجاد پروتئین‌هایی با دومین‌های متعدد کنند. پدیده فیوژن نشان می‌دهد که این پروتئین‌های ایجاد شده از نظر عملکرد با دومین‌های منفرد، مرتبط و وابسته هستند. مطالعات مختلف نشان می‌دهند اکثر وقایع فیوژن در پروتئین‌هایی دیده می‌شوند که در مسیرهای متابولیک نقش دارند.
روش کامپیوتری دو هیبرید[4]
این روش بر این اصل است که اگر در یک پروتئین اسیدآمینه‌های اصلی یا کلیدی آن تغییر یابند، اسیدآمینه‌های مرتبط با آن در پروتئینی که با آن برهمکنش دارد نیز باید دچار تغییر شوند تا ارتباط بین آنها حفظ شود. در فاز آنالیز، ژنوم‌هایی که حاوی ژن‌های کدکننده آن دو پروتئین هستند توالی‌یابی می‌شوند و ضریب همبستگی آنها برای هر دو پروتئین با استفاده از نرم‌افزار محاسبه می‌شود و بر اساس آن، میزان برهمکنش فیزیکی بین دو پروتئین تعیین می‌گردد.
درخت فیلوژنتیک[5]
درخت فیلوژنتیک نشانگر تاریخچه تکاملی پروتئین‌ها می‌باشد. روش Mirror tree واکنش‌های پروتئین- پروتئین را با این اعتقاد که پروتئین‌های برهمکنش دهنده با یکدیگر، درخت فیلوژنیک مشابهی دارند (زیرا بهمراه هم و در برهمکنش با هم تکامل یافته‌اند)، پیش‌بینی می‌کند. داده‌ها در نرم‌افزار، تجزیه و تحلیل شده و میزان همبستگی دو پروتئین بصورت عدد مشخص می‌شود.
پروفایل فیلوژنتیک[6]
این روش مبتنی بر این اصل است که پروتئین‌هایی که از نظر عملکردی بهم مرتبط هستند، بطور همزمان طی تکامل ارگانیسم وجود دارند؛ به عبارتی دیگر اگر دو پروتئین از نظر عملکرد بهم مرتبط هستند باید در طی فرایند‌های تکاملی، با هم و بطور همزمان به نسل بعدی سلول منتقل شده باشند. اگر دو پروتئین پروفایل فیلوژنی مشابهی داشته باشند به این معنی است که آن دو پروتئین با هم ارتباط عملکردی نیز دارند. مسائل مهمی که در این روش باید مد نظر قرار داد از جمله این که بسیاری از وقایع ژنتیکی طی تکامل همزمان دو پروتئین از قبیل دوبله شدن ژن یا حذف عملکرد ژن، ممکن است روی دهد که پروفایل فیلوژنیک را مختل می‌کنند؛ علاوه بر این، تحقیقات مختلف نشان می‌دهند این روش برای سلول‌های پروکاریوتی در مقایسه با یوکاریوت‌ها کارآمدتر و قابل اعتمادتر است.
بیان ژن
در این روش امکان شناسایی جامع تمام ترانسکریپتوم‌های ژن در یک ارگانیسم وجود دارد. بیان ژن به معنی کمیت‌سنجی میزان بیان ژن خالص داخل یک سلول، بافت یا ارگانیسم، تحت شرایط مختلف آزمایشگاهی و دوره‌های زمانی مشخص می‌باشد. بر این اساس، ژن‌هایی که بیان متفاوت دارند بر اساس میزان بیان، در گروه‌های مختلفی دسته‌بندی می‌شوند. بر اساس بیان یک سری ژن‌ها در شرایط آزمایشگاهی خاص و از طریق محاسبات الگوریتم و کامپیوتری می‌توان حدس زد که کدام پروتئین‌ها با یکدیگر برهمکنش دارند. در این روش باید در نظر داشت که بیان ژنی روشی غیرمستقیم برای شناسایی برهمکنش‌های پروتئینی است و ممکن است بطور قطعی قابل انتساب به همه برهمکنش‌های بین پروتئین‌ها نباشد. به منظور کاهش خطا می‌توان بیان همزمان ژن‌ها را در کنار این روش نیز انجام داد تا نتایج قابل اعتمادتر باشند.
منابع:
– Rao VS, Srinivas K1, Sujini GN, Kumar GN. Protein-protein interaction detection: methods and analysis. Int J Proteomics. 2014;2014:147648.
–Brückner A, Polge C, Lentze N, Auerbach D, Schlattner U. Yeast two-hybrid, a powerful tool for systems biology. Int J Mol Sci. 2009 Jun 18;10(6):2763-88.
–Berggard T, Linse S, James P. Methods for the detection and analysis of protein-protein interactions. Proteomics. 2007 Aug;7(16):2833-42.
-A. Zhang, Protein Interaction Networks-Computational Analysis, Cambridge University Press, NewYork, NY,USA, 2009.
–Berman H, Henrick K, Nakamura H, Markley JL. The worldwide Protein Data Bank (wwPDB): ensuring a single, uniform archive of PDB data. Nucleic Acids Res. 2007 Jan;35(Database issue):D301-3.
–Valente GT, Acencio ML, Martins C, Lemke N. The development of a universal in silico predictor of protein-protein interactions. PLoS One. 2013 May 31;8(5):e65587.
–Yamada M, Kabir MS, Tsunedomi R. Divergent promoter organization may be a preferred structure for gene control in Escherichia coli. J Mol Microbiol Biotechnol. 2003;6(3-4):206-10.
– Enright AJ, Iliopoulos I, Kyrpides NC, Ouzounis CA. Protein interaction maps for complete genomes based on gene fusion events. Nature. 1999 Nov 4;402(6757):86-90.
–Pazos F, Valencia A. In silico two-hybrid system for the selection of physically interacting protein pairs. Proteins. 2002 May 1;47(2):219-27.
-T. Sato, Y. Yamanishi, M. Kanehisa, K. Horimoto, and H. Toh, “Improvement of the mirrortree method by extracting evolutionary information,” in Sequence and Genome Analysis:Method and Applications, pp. 129–139, Concept Press, 2011.
–Craig RA, Liao L. Phylogenetic tree information aids supervised learning for predicting protein-protein interaction based on distance matrices. BMC Bioinformatics. 2007 Jan 9;8:6.
–Lin TW, Wu JW, Chang DT. Combining phylogenetic profiling-based and machine learning-based techniques to predict functional related proteins. PLoS One. 2013 Sep 19;8(9):e75940.
–Grigoriev A. A relationship between gene expression and protein interactions on the proteome scale: analysis of the bacteriophage T7 and the yeast Saccharomyces cerevisiae. Nucleic Acids Res. 2001 Sep 1;29(17):3513-9.
[1] Surface plasmon resonance
[2] Phage display
[3] Protein data banks
[4] In Silico Two-Hybrid
[5] Phylogenetic Tree
[6] Phylogenetic Profile
https://medlabnews.ir/%d9%be%d8%b1%d9%88%d8%aa%d8%a6%d9%88%d9%85%db%8c%da%a9%d8%b3-2/
برای دانلود فایل pdf بر روی لینک زیر کلیک کنید
ورود / ثبت نام
با سلام، مقاله خیلی جامع و مفید بود. ممنون.موفق باشيد.