پانل لوکمی لنفوبلاستیک حاد کودکان (ALL) بوسیله تکنیک FISH

تشخیص اختلالات ژنتیکی راجعه در لوکمی لنفوبلاستیک سلول‌های B

دکتر میرمجید مصلائی

نکات مهم تست

شناسایی تغییرات ویژه ژنتیکی عود بیماری در بیماران مبتلا به لوکمی لنفوبلاستیک حاد سلول‌های B لنفوم (B-ALL)، شامل هایپردیپلوئیدی، ترانسلوکاسیون 22؛9 (ABL1/BCR)، ترانسلوکاسیون 21؛12 (ETV6/RUNX1) و بازآرایی ژن MLL.
تست ژنتیکی نه تنها برای شناسایی ناهنجاری‌های ژنتیکی ویژه در تأیید تشخیص بیماری مفید است، بلکه برای پیگیری پیشروی بیماری و بررسی پاسخ به درمان نیز قابل استفاده است.
روش فلئورسانس هیبریداسیون درجا یا FISH، نسبت به روش‌های متعارف سیتوژنتیک در تشخیص ناهنجاری‌های ژنومی ویژه، حساس‌تر و دقیق‌تر است.
مجموعه پروب‌ها بر اساس توصیه‌های گروه انکولوژی کودکان می‌باشند.

تاریخچه بیماری

B-ALL از بیماری‌های بدخیم رده سلولی لنفوئیدی می‌باشد که اساساً در کودکان رخ می‌دهد.
B-ALL معمولاً با اختلالات عود کننده سیتوژنتیک در ارتباط است که برخی از آنها با ویژگی‌های بالینی و فنوتیپی که می‌توانند ارزش پیش‌آگهی داشته باشند، مرتبط هستند.
برای بررسی استاندارد کروموزومی به سلول‌های متافازی (سلول‌های در حال تقسیم) نیاز است؛ این روش، “استاندارد طلایی” برای تشخیص ناهنجاری‌های ژنتیکی است. با این حال گاهی مواقع، برخی بازآرایی‌های قابل مشاهده از نظر سیتوژنتیکی، ممکن است به دلیل زیر حد بهینه بودن شکل کروموزوم یا عدم دسترسی به سلول‌های در حال تقسیم، شناسایی نشوند. در یک آزمایشگاه سیتوژنتیک تشخیصی، بررسی و تجزیه تحلیل FISH در مطالعات کروموزومی برتری‌هایی دارد.

مزایای تجزیه و تحلیل FISH:

می‌تواند تعداد اندک سلول‌های غیرعادی را شناسایی کند.
مدت زمان چرخش یا انجام این تست سریع است.
این تست را می‌توان بر روی سلول‌های مرحله اینترفاز که در حال تقسیم نیستند نیز انجام داد.
قابلیت تشخیص بازآرایی‌های مشکوک یا ظریف که شناسایی آنها توسط کاریوتایپ معمولی دشوار است را دارد.
پروب‌های از هم گسیخته FISH، برای هدف گیری ژن‌های مهم با شرکای ترانسلوکاسیون یا جابجایی گوناگون، طراحی شده و می‌تواند بازآرایی‌های ژن‌های مهم را بدون توجه به شرکای جابجایی شناسایی کند. به هر حال، تشخیص ارتباط شریک ترانسلوکاسیون با مطالعات کروموزومی توصیه می‌گردد.

مطالعه شیوع بیماری

شیوع بیماری B-ALL در ایالات متحده آمریکا حدود 3 در میان 100هزار نفر است.

ژنتیک

ناهنجاری های ژنتیکی راجعه مرتبط با B-ALL در جمعیت کودکان عبارتند از:
B-ALL با [t(9;22) (q34;q11.2) (BCR/ABL-1)]
B-ALL با [t(12;21) (p13;q22) (ETV6/RUNX1)]
B-ALL با بازآرایی [11q23 (MLL)]
هایپردیپلوئیدی مرتبط با تریزومی 4 و 10

تست‌های مرتبط

پانل FISH برای B-ALL با ناهنجاری‌های ژنتیکی راجعه در کودکان

نوع پروب	نام پروب‌ها (ژن‌های درگیر)	ناهنجاری‌های کروموزومی
3 رنگ، فیوژن دوگانه	ABL1/BCR	t(9;22)
سیگنال اضافه	ETV6/RUNX1	t(12;21)
از هم گسیخته	MLL*	11q23بازآرایی
سانترومری	CEP4 و CEP10	هایپردیپلوئیدی
ژن MLL* که بر روی 11q23قرار دارد، شرکای ترانسلوکاسیون متعددی دارد. پروب از هم گسیخته FISH می‌تواند بازآرایی ژنی را شناسایی کند که رخ داده ولی نمی‌تواند شریک ترانسلوکاسیون را تشخیص دهد.

موارد درخواست تست

پانل تست FISH برای کودکان مبتلا به B-ALL در زمان تشخیص، برای طبقه بندی مناسب بیماری و تهیه اطلاعات پیش‌آگهی تکمیلی به کار می‌رود.
برای بررسی پاسخ به درمان یا پیشروی بیماری
مناسب جهت استفاده گسترده

مواد و روش‌ها

سلول‌های مغز استخوان در کشت‌های غیر تحریکی از برداشت مستقیم یا کشت‌های 24 ساعته، توسط FISH با استفاده از مجموعه‌ای از پروب‌های تجاری FISH، مورد بررسی قرار گرفتند.
هر پروب می‌تواند به طور جداگانه یا به صورت بخشی از یک پانل مورد استفاده قرار گیرد.
پروب‌های FISH (ABL1/BCR, ETV6/RUNX1, MLL, CEP4, و CEP10) برای هر بیمار به صورت جداگانه تنظیم و گذاشته می‌شوند.
حداقل 2 تکنسین، نمره هر مورد را ارزیابی می‌کنند.
200 هسته سلولی برای هر پروب ارزیابی می‌گردد.
نمونه‌های مغز استخوان 20 نفر که بیماری خونی مشخصی نداشته و کاریوتایپ نرمالی دارند، به عنوان گروه شاهد در تعیین مقدار خط مرز (cut-off) برای تنوع نرمال الگوهای پروب، مورد استفاد قرار می‌گیرد.

نکات اضافی درخواست تست

لوله با درب سبز سدیم- هپارین با 4-3 میلی‌لیتر از مغز استخوان نیاز است.
نمونه‌ها باید در دمای اتاق ذخیره شده و در دمای اتاق در خلال 24 ساعت از زمان دریافت نمونه، به آزمایشگاه انتقال داده شوند.

محدودیت‌ها

این پانل پروب تنها عدم تعادل‌های ویژه (اضافه شدن یا از دست دادن DNA) و بازآرایی‌های جایگاه‌های خاص در کروموزوم‌های مورد نظر را شناسایی می‌کند.
تغییرات کروموزومی خارج از ناحیه مکمل با پروب‌های FISH، شناسایی نخواهند شد.

رفرانس‌ها:

Heim S, Mitelman F, eds. Chromosomal and molecular genetic aberrations of tumor cells. In: Cancer Cytogenetics. 3rd ed. Hoboken, NJ: Wiley-Blackwell; 2008:1–736.
Swerdlow SH, et al, eds. WHO Classification of Tumours of Haematopoietic and Lymphoid Tissues, 4th ed. Lyon, France: International Agency for Research on Cancer; 2008.

شناسایی موتاسیون BRAF V600E، آسپیره کردن با سوزن نازک

آزمایش دقیق و حساس برای تعیین موتاسیون BRAF V600E در اسمیرهای آسپیراسیون توسط سوزن نازک

نکات برجسته تست

این تست حساس، موتاسیون BRAF V600E را شناسایی می‌کند.
نمونه آزمایش شامل اسمیرهای مستقیم سیتولوژی است که از بیوپسی آسپیراسیون سوزن نازک (FNA) تومورهای تیروئید، تومورهای ریه، یا ملانوما و همچنین غدد لنفاوی و دیگر جایگاه‌های متاستاتیک تهیه می‌شوند.

پیشینه بالینی

BRAF، ژن رمز کننده کیناز در مسیر بیولوژیک RAS/RAF/MAPK است.
موتاسیون‌های انکوژن در کودون 600 BRAF، شامل V600E، در تعدادی از سرطان‌ها از جمله کارسینومای پاپیلاری تیروئید (PTC)، ملانوما و زیرگروه کوچکی از سرطان‌های ریه، شناسایی شده است.

مطالعه شیوع بیماری

کارسینومای تیروئید: کارسینومای پاپیلاری تیروئید، 86% از سرطان‌های اولیه تیروئید را شامل می‌شود. وجود موتاسیون BRAF V600E در تومورهای اولیه تیروئید، برای PTC بسیار اختصاصی بوده و تقریباً در 45% از موارد PTC یافت می‌شود.
سرطان ریه: موتاسیون BRAF V600E در زیرگروه کوچکی از موارد سرطان ریه غیر سلول کوچک (1% تا 6%) وجود دارد.
ملانوما: موتاسیون BRAF V600E تقریباً در 45% از ملانوماها یافت می‌شود.

موارد درخواست تست

ندول‌های تیروئید که به وسیله سیتولوژی مشخص نیستند: وجود موتاسیون BRAF V600E در ندول ابتدایی تیروئید، برای تشخیص سرطان پاپیلاری تیروئید، اختصاصی است.
ندول‌های تیروئید که به عنوان کارسینومای پاپیلاری تیروئید تشخیص داده می‌شوند: وجود موتاسیون BRAF V600E می‌تواند بیمارانی را شناسایی کند که ممکن است به مهار کننده‌هایی که RAF و دیگر اعضای مسیر MEK را هدف قرار می‌دهند، پاسخ دهند.
ملانوما: وجود موتاسیون BRAF V600E مشخص می‌کند که آیا یک تومور به درمان‌هایی که مسیر بیولوژیک BRAF را هدف قرار می‌دهند، پاسخ می‌دهد یا خیر.
سرطان ریه غیر سلول کوچک: وجود موتاسیون BRAF V600E مشخص می‌سازد که آیا یک تومور به درمان‌های که مسیر بیولوژیک BRAF را هدف قرار می‌دهند، پاسخ می‌دهد یا خیر.

نکات بیشتر در مورد آزمایش

پاتولوژیست همه موارد را بررسی می‌کند تا دریابد که آیا ناحیه توموری کافی برای آزمایش دارد یا خیر. درصورتی که ناحیه قابل دسترس برای استخراج وجود نداشته باشد، نمونه‌ها در شرایط استثنا قرار می‌گیرند تا آزمایش متوقف شده و یا اسلایدهای بیشتری درخواست شود.

تفسیر آزمایش

“شناسایی شد” به معنی وجود موتاسیون BRAF V600E درون ژن BRAF است.
“تشخیص داده نشد” به معنی عدم شناسایی موتاسیون BRAF V600E در نمونه می‌باشد.

محدودیت‌های تست

موتاسیون‌های دیگر جایگاه درون ژن BRAF یا دیگر ژن‌ها، قابل شناسایی نیستند.
محدودیت تشخیص برای این آزمایش، 0/02% آلل جهش یافته از سلول‌های توموری در پس زمینه سلول‌های نرمال است.
نتایج این تست‌ها همیشه باید در ارتباط با پیشینه بالینی بیمار و با استفاده از دیگر داده‌های مرتبط تفسیر شوند و نباید به تنهایی برای تشخیص بدخیمی مورد استفاده قرار گیرند.
این تست برای شناسایی حداقل باقیمانده بیماری (MRD) کاربرد ندارد.
موتاسیون های BRAF V600E را همچنین می‌توان در کارسینوماهایی که به صورت ضعیفی تمایز یافته‌اند یا کارسینوماهای آناپلاستیک تیروئید که همچنین جزء PTC را دارند، شناسایی نمود.

مواد و روش‌ها

DNA از بافت توموری که از قطعه قطعه شدن اسلایدهای اسمیر مستقیم FNA بدست می‌آید، جدا می‌گردد.
یک ناحیه از ژن BRAF شامل کدون 600، با استفاده از PCR ویژه آلل، با بلوکه کردن پروب رقابتی، تکثیر می‌شود. موقعیت موتاسیون توسط آنالیز نمودار ذوب تعیین می‌گردد.

رفرانس‌ها

Howlader N, et al., eds. SEER Cancer Statistics Review, 1975– 2009 (Vintage 2009 Populations), National Cancer Institute. Bethesda, MD. http://seer.cancer.gov/csr/1975_2009_pops09/. Updated April 30, 2012. Accessed May 21, 2012.
Nikiforov YE. Molecular analysis of thyroid tumors. Mod. Pathol. 2011;24:(suppl):(2):S34–S43.
Smith GD, et al. Allele-specific PCR with competitive probe blocking for sensitive and specific detection of BRAF V600E in thyroid fine-needle aspiration specimens. Acta Cytol. 2011;55:576–583.
Wellbrock C, Hurlstone A. BRAF as therapeutic target in melanoma. Biochem. Pharmacol. 2010;80(5):561–567.
Yousem SA. Role of molecular studies in the diagnosis of lung adenocarcinoma. Mod. Pathol. 2012;25S (suppl):(1):S11–S17.
Zhou L, et al. Rare allele enrichment and detection by allelespecific PCR, competitive probe blocking, and melting analysis. BioTechniques. 2011;50:311–318.

شناسایی موتاسیون‌های BRAF

برای تعیین واجد شرایط بودن بیمار به منظور درمان مسیر بیولوژیک- EGFR

پیشینه بالینی

BRAF، ژن رمز کننده کیناز در مسیر بیولوژیک RAS/RAF/MAPK است.
موتاسیون‌های انکوژن در کودون 600 شناسایی شده‌اند که از جمله می‌توان موتاسیون V600E را نام برد.

موارد درخواست تست

موقعیت موتاسیون BRAF می‌تواند در تعیین اینکه آیا بیمار برای دریافت درمان‌هایی که مسیر بیولوژیک EGFR را هدف قرار می‌دهند، واجد شرایط است یا خیر، مفید باشد.

تفسیر آزمایش

نتیجه مثبت نشان دهنده حضور یک موتاسیون درون کودون 600 ژن BRAF است. حضور موتاسیون BRAF در بیمار مبتلا به ملانوم پیشنهاد کننده پاسخ مثبت به درمان با مهار کننده‌های BRAF می‌باشد.
برای بیماران مبتلا به سرطان کولورکتال متاستاتیک، حضور یک موتاسیون BRAF نشان دهنده صلاح نبودن انجام درمان‌های ویژه مانند درمان‌های ضد EGFR می‌باشد.

محدودیت‌های تست

موتاسیون‌های دیگر جایگاه درون ژن BRAF یا دیگر ژن‌ها، قابل شناسایی نیستند.
محدودیت تشخیص برای این آزمایش، 10% آلل جهش یافته است.

مواد و روش‌ها

بافت توموری به قطعات ریز تقسیم شده و DNA آن از قطعات بلوک‌های بافتی ثابت شده در پارافین، جدا می‌شود.
یک ناحیه از ژن BRAF شامل کودون 600، با استفاده از PCR تکثیر می‌شود. موقعیت موتاسیون توسط پیروسکانس تعیین می‌گردد.

تست‌های مرتبط

شناسایی موتاسیون KRAS در بازتاب به BRAF

رفرانس‌ها

Loupakis F, et al. KRAS codon 61, 146 and BRAF mutations predict resistance to cetuximab plus irinotecan in KRAS codon 12 and 13 wild-type metastatic colorectal cancer. Br J Cancer 2009;101:715–21.
Wellbrock C, Hurlstone A. BRAF as therapeutic target in melanoma. Biochem Pharmacol 2010;80(5):561–7.

موتاسیون‌های BRAF V600E در لوسمی سلول مویی

موارد درخواست تست

برای تأیید تشخیص لوسمی سلول مویی (HCL)
برای نظارت بر بار تومور در بیماران مبتلا به لوسمی سلول مویی

تشریح آزمایش

DNA ژنومی استخراج شده و قطعه پوشا کدون BRAF V600E، برای نوع وحشی و آلل جهش یافته BRAF V600E، با PCR و توسط پرایمر ویژه آلل تکثیر می‌شود.
توسط پروب آبکافت (هیدرولیز) محاسبه کمی انجام می‌شود.
درصدهای نسبی نوع وحشی BRAF V600 و آلل جهش یافته BRAF V600E با استفاده از یک پلاسمید کالیبره هتروزیگوت محاسبه می‌شود.

آزمایشاتی که باید مورد توجه قرار گیرند:

آزمایش ابتدایی
شناسایی موتاسیون BRAF V600E در لوسمی سلول مویی توسط real-time PCR، کمی
برای تأیید تشخیص HCL و برای نظارت بر بار تومور
آزمایشات مرتبط
تعیین فنوتیپ لوسمی/ لنفوم (خون کامل- جامع)
آزمایش اولیه برای تعیین دودمان تومور
تعیین فنوتیپ لوسمی/ لنفوم (مغز استخوان- جامع)
آزمایش اولیه برای تعیین دودمان تومور

مروری بر بیماری

شیوع: ناهنجاری لنفوپرولیفراتیو نادر
موارد تشخیصی:
مارکر مولکولی قابل اعتماد برای تأیید تشخیص HCL
موتاسیون‌های BRAF V600E تقریباً در تمامی موارد لوسمی سلول مویی شناسایی می‌شوند اما در دیگر ناهنجاری‌های لنفوپرولیفراتیو نادر هستند.
موارد درمان:
کمیت سنجی بار آلل اجازه می‌دهد تا پاسخ‌گویی به درمان مورد نظارت قرار گیرد.

ژنتیک

ژن: BRAF
ساختار/عملکرد:
پروتئین کیناز BRAF در مسیر سیگنالینگ پروتئین کیناز فعال شده توسط میتوژن/RAS، عمل می‌کند.
نقش اصلی را در تکثیر سلولی، بقا، و تغییر شکل نئوپلاستیک دارد.
موتاسیون:
اغلب موتاسیون‌ها در کدون V600 رخ می‌دهند.
جهش، منجر به تغییر V600E می‌شود.

تفسیر آزمایش

حساسیت تحلیلی: 0/2% آلل جهش یافته
نتیجه مثبت:
مثبت- آلل BRAF V600E شناسایی و اندازه‌گیری شده است.
مثبت ضعیف، غیر قابل اندازه‌گیری- موتاسیون BRAF V600E در 0/4-0/2% آلل جهش یافته شناسایی شده است.
محدودیت‌های تست:
این تست نباید به تنهایی برای تشخیص بدخیمی مورد استفاده قرار گیرد.
محدوده تشخیصی این تست، 0/2% آلل جهش یافته است.

شناسایی موتاسیون‌های BRAF V600E و متیلاسیون پروموتر MLH1 در سرطان کولورکتال

برای تمایز سرطان‌های پراکنده کولورکتال با ناپایداری میکروستلایت (ضایعه مختصری که در نزدیکی ضایعه اصلی وجود دارد)، از اشکال وراثتی سرطان‌های کولورکتال (سندرم لینچ/سرطان وراثتی کولورکتال بدون پولیپوز {HNPCC})

نکات برجسته تست

شناسایی وجود موتاسیون BRAF V600E در تومورهای کولورکتال
شناسایی متیلاسیون در ژن MLH1
کمک به تصمیم گیری درباره اینکه آیا بررسی‌ها بیشتر برای سندرم لینچ نیاز است یا خیر

پیشینه بالینی

ناپایداری میکروستلایت می‌تواند شاخصی برای سندرم لینچ باشد؛ با این حال، این مورد در تومورهای اسپورادیک یا پراکنده نیز دیده می‌شود.
BRAF، ژن رمز کننده کیناز در مسیر بیولوژیک RAS/RAF/MAPK است. مطالعات نشان داده‌اند که وجود موتاسیون BRAF V600E در توموری با ناپایداری میکروستلایت بیانگر این موضوع است که تومور احتمالاً پراکنده است و با سندرم لینچ در ارتباط نیست.
متیلاسیون پروموتر MLH1 نیز مشخص می‌کند که تومور دارای ناپایداری میکروستلایت، احتمالاً پراکنده بوده و با سندرم لینچ مرتبط نیست.

موارد درخواست تست

زمانی که به وسیله رنگ آمیزی ایمونولوژیکی مشخص می‌شود که نمونه بافتی تومور کولورکتال MLH1 ندارد، و یا ناپایداری میکروستلایت با روش PCR مشخص می‌گردد، آنالیز موتاسیون BRAF V600E و آنالیز متیلاسیون MLH1 باید انجام شود. سپس نتایج تست می‌تواند برای تعیین اینکه آیا بررسی بیشتر برای تشخیص سندرم لینچ مورد نیاز است یا خیر، مورد استفاده قرار گیرد.
نمونه بافتی توموری که برای آنالیز موتاسیون ژن BRAF مورد استفاده قرار می‌گیرد، در صورتی که فاقد موتاسیون BRAF V600E باشد، به صورت خودکار به آنالیز متیلاسیون MLH1 منعکس می‌شود.

تفسیر آزمایش

اگر موتاسیون BRAF V600E یا متیلاسیون پروموتر MLH1 در یک نمونه بافتی تومور یافت شود که نشان دهنده ناپایداری میکروستلایت است، بنابراین احتمالاً تومور پراکنده بوده و انجام بررسی‌های بیشتر برای تشخیص سندرم لینچ منطقی نیست.
در صورتی که نه موتاسیون BRAF V600E و نه متیلاسیون MLH1 یافت شود، تومور به احتمال بیشتر اسپورادیک نبوده و بررسی‌های بیشتر برای شناسایی سندرم لینچ باید صورت پذیرد. از آنجا که گزارشات بسیار نادری از موتاسیون BRAF V600E یا متیلاسیون MLH1 در تومورهای مرتبط با سندرم لینچ وجود دارد، تمامی نتایج باید در زمینه سابقه بالینی بیمار مورد تفسیر قرار گیرند.

محدودیت‌های تست

موتاسیون‌هایی غیر از آنهایی که درون کدون 600 ژن BRAF قرار دارند، قابل شناسایی نیستند.
موتاسیون‌های بیشتر درون پرایمر یا نواحی جایگاه پروب می‌تواند این تست را تحت تأثیر قرار دهد.
وجود کمتر از 10% آلل جهش یافته قابل شناسایی نیست. متیلاسیون در جایگاه‌هایی غیر از آنهایی توسط پرایمرها و پروب‌ها پوشانده می‌شوند، قابل شناسایی نیست.
سطوح متیلاسیون کمتر از 10% گزارش نشده است.
نتایج این تست‌ها همیشه باید در ارتباط با پیشینه بالینی بیمار و با استفاده از دیگر داده‌های مرتبط تفسیر شوند و نباید به تنهایی برای تشخیص بدخیمی مورد استفاده قرار گیرند.
این تست برای شناسایی حداقل باقیمانده بیماری (MRD) کاربرد ندارد.
این تست برای تومورها با رنگ آمیزی ایمونولوژیکی MLH1 دست نخورده و کامل، کاربرد ندارد.

مواد و روش‌ها

اسلایدها از قطعات بلوک‌های بافتی فیکس شده با فرمالین و قرار گرفته در پارافین (FFPE) تهیه می‌شوند.
DNA از بافت توموری که از قطعه قطعه شدن اسلایدهای آماده شده بدست می‌آید، جدا می‌گردد.
اگزون 15 ژن BRAF با استفاده از PCR تکثیر می‌شود که برای تعیین وضعیت موتاسیون، توسط پیروسکانسینگ دنبال می‌شود.
اگر نمونه بافتی برای موتاسیون BRAF V600E منفی باشد، سپس برای متیلاسیون MLH1 مورد آزمایش قرار می‌گیرد. DNA با سدیم بی‌سولفیت تیمار می‌شود، و کار بوسیله تکثیر یک قطعه از ناحیه پروموتر MLH1 توسط real-time PCR ویژه متیلاسیون، دنبال می‌گردد. سطح متیلاسیون MLH1 توسط مقایسه با تقویت یک ژن مرجع، محاسبه می‌شود.

تست‌های مرتبط

سندرم HNPCC/لینچ، ناپایداری میکروستلایت با PCR
ترمیم عدم تطابق توسط ایمونوهیستوشیمی
شناسایی موتاسیون کدون 600 BRFA بوسیله پیروسکانسینگ

رفرانس‌ها

Funkhouser WK Jr, et al. Relevance, pathogenesis, and testing algorithm for mismatch repair-defective colorectal carcinomas: a report of the Association for Molecular Pathology. J Mole Diagn. 2012;14:91–103.
Gudgeon JM, et al. Lynch syndrome screening implementation: business analysis by a healthcare system. Am J Manag Care. 2011; 17:e288–300.
Parsons MT, et al. Correlation of tumour BRAF mutations and MLH1 methylation with germline mismatch repair (MMR) gene mutation status: a literature review assessing utility of tumour features for MMR variant classification. J Med Genet. 2012;49:151–157.

برای دانلود فایل pdf بر روی لینک زیر کلیک کنید

برای دانلود باید وارد سایت شوید.

خواندن تمام مطلب