مقاله مروری
رهنمودهای ICSH برای استانداردسازی نمونه‌ها و گزارش‌های مغز استخوان (3)
دکتر طاهره اسلام منش، استادیار پاتولوژی دانشگاه علوم پزشکی رفسنجان
گزارش نمونه‌های آسپیراسیون مغز استخوان
ظاهر نمونه آسپیره و بیوپسی باید با یکدیگر ارتباط داده شود و اگر مغایرت فاحشی وجود دارد، دلیل آن توضیح داده شود. مطلوب است که گزارش آسپیره و بیوپسی به‌صورت یک گزارش واحد باشد.
گزارش آسپیره باید دربرگیرنده نتایج شمارش خونی، مثلاً غلظت هموگلوبین، تعداد کل و افتراقی گلبول‌های سفید (نوتروفیل، ائوزینوفیل، بازوفیل، منوسیت، لنفوسیت و در صورت وجود دیگر سلول‌های در گردش خون) و تعداد پلاکت و تفسیر خون محیطی باشد. کافی بودن نمونه آسپیره باید در گزارش ذکر شود. اگر ذرات در اسمیر BM وجود دارد (دارای ذرات یا فاقد ذرات) یا اگر آسپیراسیون dry است یا با خون رقیق شده است باید ذکر شود.
سلولاریتی ذرات مغز استخوان باید با بررسی چندین ذره در اسمیرها یا نمونه‌های ناشی از خرد شدن (squash) صورت گیرد. سلولاریتی در نمونه‌های squash بهتر از اسمیرها ارزیابی می‌شود. سلولاریتی به‌صورت بدون سلول، کاهش‌یافته، طبیعی، افزایش‌یافته یا بسیار افزایش‌یافته توصیف می‌شود. در کل ارزیابی سلولاریتی کلی مغز استخوان در برش‌های بیوپسی بهتر از آسپیره است. سلولاریتی ذرات و دنباله‌ها می‌تواند متفاوت باشد، مثلاً در مغز استخوان‌های فیبروتیک که باید جداگانه شرح داده شود. ذرات با نمای غیرطبیعی باید جداگانه ذکر شود، مثلاً نکروتیک، ژلاتینوس و ادماتوس. وجود رنگ‌پذیری زمینه اسمیر یا مواد پروتئینی بین‌سلولی، رولو یا کریستال‌ها باید گزارش شود. تفاسیر کمی و کیفی برای همه رده‌های سلولی و همه سلول‌های غیرطبیعی انجام می‌شود. تعداد (کاهش‌یافته، طبیعی یا افزایش‌یافته)، بلوغ طبیعی است یا غیرطبیعی و مورفولوژی رده‌های اریتروئید و میلوئید باید ذکر شود و در صورت غیرطبیعی بودن شرح داده شود. تعداد و مورفولوژی مگا‌کاریوسیت‌ها را قید می‌کنیم. تعداد آن‌ها در نمونه بیوپسی بهتر ارزیابی می‌شود. زمانی که تعداد ماکروفاژها افزایش یافته است باید ذکر کنیم و مورفولوژی غیرطبیعی (مثل همو یا اریتروفاگوسیتوز، وجود انکلوزیون‌ها مثل میکروارگانیسم‌ها یا کریستال‌ها، واکوئل‌ها یا هیستیوسیت‌های sea-blue) ثبت شود. افزایش تعداد ماست‌سل‌ها و هر نمای مورفولوژیکی آتیپیک یا تجمعات باید ذکر شود. هر سلول غیرطبیعی یا تجمعات سلول توموری متاستاتیک باید شرح داده شود و وجود تعداد قابل‌توجه سلول‌های smudged باید ثبت شود. نتایج رنگ‌آمیزی آهن و دیگر بررسی‌های سیتوشیمی باید گزارش شود.
یافته‌های فلوسیتومتری مرتبط، در صورت وجود، باید در گزارش آسپیره به‌صورت خلاصه آورده شود. گزارش نتیجه آسپیراسیون نباید به علت آماده نبودن نتایج بررسی‌های تکمیلی به تأخیر بیفتد. باید در گزارش اولیه اشاره کرد که بررسی‌های تکمیلی در حال انجام است. زمانی که نتایج بررسی‌های ژنتیک مولکولی شناخته شده است و بر روی تشخیص تأثیر می‌گذارد باید در یک گزارش تکمیلی قید شود. اگر نتایج بررسی‌های تکمیلی باعث تغییر تشخیص شود، یک گزارش اصلاح‌شده تهیه می‌شود.
اگر اسلایدها توسط فرد دیگری بازبینی شده است باید در گزارش نام فرد مشاور ذکر شود یا گزارش توسط هر دو نفر امضا شود.
نتیجه‌گیری گزارش آسپیره BM باید تشخیص یا تشخیص افتراقی را با توجه به گایدلاین‌های مجامع بین‌المللی بیان کند. یافته‌های اصلی باید خلاصه شود و بررسی‌های دیگری که انجام شده است، ذکر گردد. اگر آسپیره برای مانیتورینگ بیماری است یافته‌ها باید با گزارش‌های قبلی BM مقایسه شود. اگر آسپیره برای تائید یک تشخیص کلینیکی است و نتیجه منفی است باید ذکر شود. کد مناسب بیماری بر اساس SNOMED CT یا ICD باید ذکر گردد.
گزارش باید به‌صورت دستی یا الکترونیکی امضا شود و تاریخ قید شود.
نمونه‌های بیوپسی ترفین مغز استخوان
جمع‌آوری نمونه‌های بیوپسی مغز استخوان
بیوپسی مغز استخوان قبل یا بعد از آسپیراسیون انجام می‌شود. طول بيوپسي در بالغین باید حداقل 2 سانتی‌متر باشد، البته یک بیوپسی کوتاه‌تر (مثلاً 1 سانتی‌متر) نيز گاهی اوقات حاوی اطلاعات تشخیصی کافی است. نمونه بیوپسی بعد از آماده‌سازی تقریباً 20 درصد کوچک‌تر می‌شود. هر چه مقدار بافت بیوپسی شده بزرگ‌تر باشد، احتمال یافتن یک ضایعه کانونی (مثل لنفوما، تومور متاستاتیک، گرانولوم) بیشتر است. گاهی بیوپسی‌های ترفین دوطرفه برای افزایش احتمال تشخيص ضایعات کانونی به کار می‌رود.
هنگامی‌که نمونه بيوپسي گرفته شد، یک استایلت بلانت (blunt stylet) از انتهای دیستال وارد سوزن بیوپسی می‌شود تا نمونه از انتهاي پروگزیمال سوزن بیوپسی خارج شود و بر روی یک اسلاید شیشه‌ای قرار گيرد. براي جلوگيري از خردشدگی و تخريب، كار با نمونه به‌آرامی انجام می‌شود.
Touch imprints باید از نمونه بیوپسی قبل از قرارگیری در فیکساتیو تهیه شود. Imprints به‌ویژه در مواقعی که آسپیره مغز استخوان dry است مفيد می‌باشد.Imprints از طريق تماس آرام نمونه بيوپسي تازه و فيكس‌نشده روي اسلايد و يا قرارگيري اسلايد روي نمونه به دست می‌آید. Imprints با همان روش نمونه‌هاي آسپيره و squash فيكس و رنگ‌آمیزی می‌شوند. اگر هیچ نمونه آسپیراسیوني در دسترس نباشد، Imprints تنها نمونه‌ای است كه بررسي تركيب سلولي، جزئيات سيتولوژيكي و شمارش سلول‌های هسته‌دار بر روي آن‌ها انجام می‌شود. پس از تهيه Imprints، نمونه بيوپسي در یک ظرف حاوي فيكساتيو مناسب قرار می‌گیرد. ظرف نمونه باید به‌طور مناسب در کنار تخت بيمار، با نام و نام خانوادگی بیمار، شناسه منحصربه‌فرد بیمار و تاریخ و زمان جمع‌آوری نمونه برچسب زده شود، به‌طوری‌که زمانی که نمونه بیوپسی باید از فيكساتيو بيرون آورده شود قابل‌محاسبه باشد.
فیکساسیون
نمونه‌های بیوپسی با یک متد یا متدهای مختلف فیکس می‌شود. روش‌های فیکساسیون می‌تواند به‌طور قابل‌توجهی مورفولوژی، جزئیات سیتولوژی و ایمونوراکتیویتی را تحت‌تأثیر قرار دهد. یک فیکساتیو استاندارد، فرمالین بافری خنثی برای 6 ساعت است. فیکساتیوهای دیگری که به‌طور شایع استفاده می‌شود عبارتند از فرمالدئید روی، B5 (کلریدجیوه، استات‌سدیم و فرمالین)،AZF (اسید استیک-روی-فرمالین)، IBF (فرمالین بافری ایزوتونیک)، فیکساتیو بوئن (اسید پیکریک، اسید استیک و فرمالدئید) یا فرمالدئید و گلوتارآلدئید. زمان فیکساسیون بسته به نوع فیکساتیو استفاده‌شده از حداقل یکساعت تا ماکزیمم بیشتر از 24 ساعت است. اگرچه B5 مورفولوژی خوب و زمان چرخه کاری کوتاهی دارد، حاوی کلریدجیوه است که به علت مسائل ایمنی و محیطی در چندین کشور ممنوعیت دارد. اسید پیکریک که در فیکساتیو بوئن استفاده می‌شود یک ماده قابل‌انفجار است و در ایالات متحده ممنوعیت دارد. فرمالین بافری خنثی با کلسیفیکاسیون EDTA منجر به مورفولوژی مناسب و حفظ آنتی‌ژن‌ها برای بررسي ایمونوهیستوشیمی و حفظ اسیدهای نوکلئیک برای بررسی‌های مولکولار می‌شود.
آماده‌سازی نمونه ترفین بیوپسی
بعد از دکلسیفیکاسیون، نمونه بیوپسی در پارافين تعبيه می‌شود و برش‌ها با میکروتوم انجام می‌شود. ضخامت مناسب برش‌ها 2 تا 3 میکرون است. حداقل 6 برش در سه سطح تهیه می‌شود؛ 25 درصد، 50 درصد و 75 درصد. قطر سطح مقطع نمونه و برش‌های متوالی باید روی اسلاید شیشه‌ای قرار داده شود. اگر ایمونوهیستوشیمی یا رنگ‌های هیستوشیمی نیاز است، برش‌های اضافه‌تری تهیه شود. نمونه‌های بیوپسی مغز استخوان در پلاستیک هم می‌تواند تعبيه شود. این روش جزئیات سیتولوژی را به‌خوبی حفظ می‌کند ولی ازنظر تکنیکی دشوارتر است و دامنه بررسی‌های ایمونوهیستوشیمی و احتمالاً FISH را محدود می‌کند. تعبيه‌سازي (embedding) با پلاستیک نیاز به دکلسیفیکاسیون ندارد و برای ارزیابی بیماری‌های متابولیک استخوانی و واکنش‌های هیستوشیمی که با روش دکلسیفیکاسیون تداخل دارد، احتمالاً مفید است.
رنگ‌آمیزی برش‌ها
برش‌های ترفین بیوپسی باید با هماتوکسیلین و ائوزین رنگ‌آمیزی شود. گاهی رنگ‌آمیزی گیمسا هم علاوه بر هماتوکسیلین-ائوزین انجام می‌شود. رنگ گیمسا برای شناسایی پلاسماسل‌ها، ماست‌سل‌ها، سلول‌های لنفوئیدی، ائوزینوفیل‌ها و برای افتراق بین میلوبلاست‌ها و پرواریتروبلاست‌ها تا حدی کمک‌کننده است. امکان دارد یک برش بافتي براي رنگ‌آمیزی رتیکولین با silver impregnation method استفاده شود. یک برش مغز استخوان که قبلاً نشان داده شده است که افزایش رتیکولین دارد باید به‌عنوان کنترل مثبت در نظر گرفته شود، زیرا روش‌های رنگ‌آمیزی silver impregnation وابسته به فیکساسیون هستند. امکان دارد رنگ‌آمیزی تری‌کروم برای شناسایی فیبروز کلاژنی استفاده شود که به‌آسانی در نمونه‌های هماتوکسیلین-ائوزین خوب رنگ شده، قابل‌تشخیص است.
میکروسکوپی
به‌طور روتین باید 2 تا 4 برش بررسی شود. در استیجینگ لنفوما و در مواردی که شک به انفیلترای متاستاتیک وجود دارد، اگر برش‌های بیشتری بررسی گردد، شانس تشخیص یک ضایعه کانونی افزایش می‌یابد. اگر IHC انجام شده است برش‌های بیشتری بررسی خواهد شد. برش‌های بیوپسی به‌ویژه برای ارزیابی سلولاریتی و ساختار کلی مغز استخوان مفید است و حساسیت بیشتری برای ارزیابی ضایعات کانونی و انفیلتراهای پچی دارد. درصد سلولاریتی با تخمین نسبت سلول‌های اشغال‌کننده کل حفره مغز استخوان به دست می‌آید. سلولاریتی مغز استخوان بر اساس سن فرق می‌کند و با توجه به سن بیمار باید ارزیابی شود. در نمونه‌های اطفال سالم، سلولاریتی در بیماران زیر 2 سال بالاترین مقدار است (تقریباً 80 درصد) و در بیماران 2 تا 4 سال (تقریباً 70 درصد) و 5 تا 9 سال (تقریباً 60 درصد) کاهش می‌یابد. در کل نمونه‌های ستیغ ایلیاک تدریجی از سلولاریتی 60 درصد بعد از بلوغ به 30 درصد تا دهه 8 می‌رسد. دامنه نرمال وسيع، اغلب اين روند رو به پايين را می‌پوشاند که تا حدی مربوط به از دست رفتن توده استخوانی ترابکولار در افراد مسن است. فضاهای بین ترابکولار که مجاور کورتکس قرار دارند اغلب هایپوسلولار هستند، به‌ویژه در افراد مسن و نباید در ارزیابی سلولاریتی مدنظر قرار گيرد.
برش‌های بیوپسی در ابتدا با بزرگنمایی کم (X40-X100) برای کافی بودن، پترن، سلولاریتی، وجود ضایعات کانونی، تعداد مگاکاریوسیت، دستجات سلولی غیرطبیعی و موقعیت قرارگیری آن‌ها، ساختاراستخوانی (ضخامت و تعداد ترابکول ها) و فعالیت استئوبلاستی و استئوکلاستی بررسی می‌شود. سپس برش‌ها با بزرگنمایی بالاتر (X200-X400) برای ارزیابی فعالیت هماتوپویتیک (مثلاً رده‌های اریتروئید، میلوئید، مگاکاریوسیتی، سلول‌های لنفوئیدی، پلاسماسل‌ها و ماکروفاژها) و جزئیات سیتولوژیکی بررسی می‌شـــــود. بزرگنمایی‌های بیشتر (X600-X1000) برای بررسی جزئیات سیتولوژیکی مثل گرانول‌های داخل سلولی و آئر راد مفید است.
بررسی‌های تکمیلی
امكان دارد ایمونوهیستوشیمی برای تعیین رده و مرحله تمایز سلول‌های طبیعی یا غیرطبیعی یا انفیلتراهای سلولی، تعیین بیماری باقیمانده، مانیتورینگ یک فنوتیپ سلولی خاص، ارزیابی وسعت بیماری و بیماری کانونی، طبقه‌بندی بیماری، مارکرهای تعیین‌کننده پروگنوز، تعیین کلونالیتی و مانیتورینگ بیماری کاربرد داشته باشد. اگرچه درصورتی‌که فنوتیپ جمعیت سلولی غیرطبیعی قبلاً از روی نمونه آسپیراسیون تشخیص داده شده است (مثلاً با فلوسیتومتری)، انجام IHC بر روی نمونه بیوپسی مغز استخوان ضرورت ندارد. بعضی از مارکرهای فنوتیپی با IHC بر روی نمونه‌های بیوپسی مغز استخوان ارزیابی می‌شود، مثلاً نوکلئوفسمین در لوکمی میلوئیدی حاد.IHC با روش‌های ایمونوپراکسیداز یا ایمونوآلکالین فسفاتاز به‌صورت دستی یا اتوماسیون قابل انجام است. انجام روتین IHC بر روی تمام نمونه‌های بیوپسی توصیه نمی‌شود.
طیف وسیعی از آنتی‌بادی‌های منوکلونال بر روی برش‌های بیوپسی دکلسیفیه شده فیکس‌شده قابل انجام است. پانل آنتی‌بادی‌های درخواستی بستگی به ليست تشخیصی دارد. اصول مشابهی برای هیبریدیزاسیون درجا بر روی نمونه‌های بیوپسی مغز استخوان بکار می‌رود، گرچه بعضی از فیکساتیوها و مواد دکلسیفیه‌کننده انجام هیبریدیزاسیون درجا را غیرممکن می‌سازد.
رنگ‌آمیزی‌های هیستوشیمی مفید شامل کنگو رد برای آمیلوئیدوز، ذیل نلسون برای باسیل‌های اسید فست، Gomori’s methenamine silver (GMS) براي قارچ‌ها و پریودیک اسید شیف (PAS) برای کربوئیدرات‌ها است.
اگر آسپیره dry یا بدون ذره باشد، برش‌ها با آبی پروس برای ارزیابی ذخیره آهن رنگ می‌شود، اگرچه کلسیفیکاسیون، ذخیره آهن و آهن سیدروبلاستی را حذف می‌کند.
گزارش بیوپسی
در گزارش طول کلی بیوپسی، نمای ماکروسکوپی و کافی بودن آن، پیوستگی و کیفیت نمونه باید ذکر شود. درصد سلولاریتی، پترن سلولاریتی و هرگونه نواحی نکروتیک، فیبروتیک یا هموراژیک باید ذکر شود. اگر ساختار استخوان غیرطبیعی است باید ذکر شود. باید ترکیب سلولی از لحاظ موقعیت، درصد سلول‌ها، مورفولوژی و پترن تمایز رده‌های اریتروئید، میلوئید، مگاکاریوسیتی، سلول‌های لنفوئیدی، پلاسماسل‌ها و ماکروفاژها شرح داده شود. وجود هرگونه سلول غیرطبیعی ذکر شود. گرید رتیکولین و نتایج ایمونوهیستوشیمی و رنگ‌آمیزی هیستوشیمی، چه مثبت یا منفی، باید گزارش شود، درصورتی‌که انجام شده است. نتایج FISH هم باید ضمیمه شود، اگر انجام شده است. اگر بیوپسی برای استیجینگ لنفوما انجام شده است، مغز استخوان‌های درگیر باید با نمونه مغز استخوان تشخیصی اولیه مقایسه شود و شباهت‌ها و اختلاف‌ها در گرید هیستولوژی ذکر شود.
نتیجه‌گیری باید یافته‌ها و تشخیص و تشخیص‌های افتراقی را با توجه به دستورالعمل‌های مجامع بین‌المللی خلاصه نماید.
گزارش بیوپسی باید با یافته‌های آسپیراسیون ارتباط داده شود و هرگونه مغایرتی ذکر شود. یافته‌های مرتبط باید با نتایج قبلی همان بیمار مقایسه شود. هرگونه بررسی بیشتری که در حال انجام است باید ذکر شود و نتایج در یک گزارش تکمیلی در تاریخ بعدی آورده شود. گزارش به‌صورت دستی یا الکترونیکی امضاء شود و تاریخ قید گردد.
ادامه دارد…
Reference:
S.-H. Lee, W. N. Erber, A. Porwit, M. Tomonaga, L. C. Peterson– For The International Council For Standardization In Hematology. ICSH guidelines for the standardization of bone marrow specimens and reports. Int. Jnl. Lab. Hem. 2008, 30, 349–364
رهنمودهای ICSH برای استانداردسازی نمونه‌ها و گزارش‌های مغز استخوان (1)
رهنمودهای ICSH برای استانداردسازی نمونه‌ها و گزارش‌های مغزاستخوان (2)
برای دانلود فایل pdf بر روی لینک زیر کلیک کنید
ورود / ثبت نام