مقاله مروری
رهنمودهای ICSH برای استانداردسازی نمونه‌ها و گزارش‌های مغز استخوان (2)
دکتر طاهره اسلام‌منش، استادیار پاتولوژی دانشگاه علوم پزشکی رفسنجان
آماده‌سازی اسمیرهای آسپیراسیون
اسمیرهای مغزاستخوان بلافاصله بعد از آسپیراسیون باید تهیه شوند. اسمیرهای تهیه شده از نمونه EDTA باید هرچه زودتر برای کاهش اختلالات مربوط به نگهداری نمونه آماده شوند. برای آماده‌سازی اسمیرها، مواد آسپیره شده به داخل ظرف پلاستیکی یا شیشه سیلیکونی کوچک ریخته می‌شود و از یک پیپت پاستور برای بیرون کشیدن ذرات استفاده می‌شود. ذرات روی اسلایدهای شیشه‌ای قرار داده می‌شود و سپس اسمیر تهیه می‌گردد. همچنین می‌توان یک قطره از نمونه آسپیره را روی اسلاید شیشه‌ای قرار داده و سپس خون اضافی با کج کردن اسلاید خارج می‌شود و یا خون اضافی با یک پیپت پاستور یا سرنگ پلاستیکی قبل از تهیه اسمیر آسپیره می‌شود. اسمیرها با یک گسترش دهنده شیشه‌ای با سطح اریب تهیه می‌شوند، به طوریکه عرض گسترش دهنده باریک‌تر از عرض اسلاید نمونه است. گسترش دهنده در جلوی قطره آسپیره در یک زاویه تقریباً 30 درجه قرار گرفته و به عقب کشیده می‌شود تا با قطره تماس پیدا کند و قطره در طول خط تماس با اسلاید گسترش پیدا کند. سپس گسترش دهنده با حرکت یکنواخت در تماس با اسلاید به جلو کشیده می‌شود. حداقل 6 اسمیر و 2 نمونه له شده (particle squash) باید تهیه شود. برای تهیه نمونه له شده یک قطره از مغز استخوان حاوی پارتیکل در قسمت میانی اسلاید قرار داده می‌شود و اسلاید دوم روی اسلاید اول قرار می‌گیرد. وزن اسلاید دوم روی اولی برای له کردن ذرات مغزاستخوان کافی است و نیروی رو به پایین نباید استفاده شود. اسلایدها در جهت محور طولی اسلاید از همدیگر جدا می‌شوند. اسمیرهای مغزاستخوان و نمونه‌های له شده باید در کنار بستر بیمار با نام و نام خانوادگی، شناسه منحصر بفرد بیمار و تاریخ، برچسب‌گذاری شوند. اسلایدهای شیشه‌ای باید از نوع شیشه مات (frosted glass) باشد به طوری که بتوان جزئیات را با مداد روی آن نوشت.
آماده‌سازی لخته‌های ذرات (particle clots)
امکان دارد نمونه‌های لخته ذرات، اطلاعات اضافه‌تری را فراهم کند و زمانی که ترفین بیوپسی گرفته نشده باشد یا در صورتی که احتمال دهیم بیوپسی کافی نیست، تهیه می‌شود. برای تهیه لخته ذرات، آسپیره روی یک clock glass پخش می‌شود و با استفاده از یک پیپت یا یک سوزن 21-gauge ذرات مغزاستخوان جمع‌آوری و روی کاغذ صافی قرار داده می‌شود. امکان دارد پودر ترومبین گاوی (thrombostat) برای تسهیل لخته‌سازی استفاده شود. همانند نمونه‌های بیوپسی، لخته به داخل یک لوله حاوی فیکساتیو مناسب قرار گرفته و مثل نمونه‌های بیوپسی پردازش می‌شود، به جز اینکه نیازی به دکلسیفیکاسیون نیست. برش‌های لخته ذرات برای ارزیابی سلولاریتی مغزاستخوان، مورفولوژی مگاکاریوسیتی یا ارتشاح سلول‌های توموری، همینطور برای ایمونوهیستوشیمی یا FISH استفاده می‌شود. یک مزیت مهم نمونه‌های لخته ذرات، فقدان آسیب اسیدنوکلئیک یا پروتئین وابسته به دکلسیفیکاسیون است. برش‌های لخته مثل نمونه‌های ترفین بیوپسی گزارش می‌شود.
رنگ‌آمیزی اسلایدهای آسپیره مغزاستخوان
دو اسمیر خشک شده در هوا و یک نمونه له شده باید با متانول مطلق تازه بدون استون فیکس شود و با رنگ رومانوسکی مثل MGG یا رایت گیمسا رنگ‌آمیزی شود. یک اسمیر فیکس شده با متانول و یک اسلاید نمونه له شده باید با آبی پروس (واکنش پرل) رنگ‌آمیزی شود و با Safranin-O یا
Kernecht Red (nuclear fast red) رنگ‌آمیزی متقابل شود. روی همه اسمیرهای مغزاستخوان با استفاده از ماده مونت‌کننده‌‌ای که سریع سخت و خشک شود، لامل قرار داده می‌شود. امکان دارد ماده مونت‌کننده حاوی اجزاء ارگانیک توکسیک مثل تولوئن یا گزیلن باشد و باید با اقدامات احتیاطی مناسب با آن کار کرد. توصیه می‌شود در این موارد از هود chemical fume استفاده شود. بعد از رنگ‌آمیزی باید روی اسلاید یک برچسب کاغذی با جزئیات هویت بیمار و تاریخ چسبانده شود. بقیه اسلایدها برای سیتوشیمی (مثلاً میلوپراکسیداز یا استراز غیراختصاصی)،IHC، FISH به کار می‌رود و یا به صورت اسمیرهای فیکس نشده و رنگ‌آمیزی نشده بایگانی می‌شود.
اسلایدهای اضافی آسپیره مغزاستخوان به صورت محکم در فویل آلومینیومی برای نگهداری در 20- درجه سیلیسیوس برای حفظ آنتی‌ژن‌های سلولی پیچیده می‌شوند و در پردازش‌های بعدی زمانی که به دمای اتاق رسیدند از فویل بیرون آورده می‌شوند. اسمیرهای آسپیره فیکس نشده و رنگ‌آمیزی نشده که در دمای اتاق برای مدت طولانی نگهداری می‌شوند نتایج متغیری روی کیفیت رنگ‌آمیزی گیمسا دارند. اسلایدهای آسپیره فیکس شده در متانول مطلق، DNA (و احتمالاً بسیاری از آنتی‌ژن‌ها) را برای FISH یا استخراج DNA و آمپلیفیکاسیون PCR حفظ می‌کند.
میکروسکوپی
اسمیر مغزاستخوان یا نمونه له شده باید اول با بزرگنمایی کم (x100) برای تعیین تعداد و سلولاریتی ذرات، تعداد مگاکاریوسیت‌ها و برای اسکن تجمعات سلول‌های غیرطبیعی و سلول‌های غیرطبیعی با انسیدانس پایین دیده شود. نواحی سلول‌های مغزاستخوان خوب گسترش یافته در دنباله‌های سلولار اسمیر مغزاستخوان در پشت ذرات برای ارزیابی در بزرگنمایی‌های بالاتر (مثلاً x200 ,x400 ,x600 ,x1000) برای ارزیابی مورفولوژیکی سلول‌ها از جمله جزئیات سیتولوژیکی، انگل‌ها یا انکلوزیون‌های سلولی انتخاب می‌شوند. اسمیرهای مغزاستخوان برای بررسی جزئیات سلولی و شمارش افتراقی سلول‌ها مفید هستند. نمونه له شده برای ارزیابی سلولاریتی، تعداد مگاکاریوسیت‌ها، بیماری کانونی (مثلاً لنفوما، پلاسماسل میلوما، ماست‌سل‌ها، کارسینوم متاستاتیک، هیستیوسیت‌های ذخیره‌ای، گرانولوم‌ها)، مغزاستخوان فیبروتیک و تعیین سلول‌های غیرطبیعی با انسیدانس پایین مفید است. در غیاب ذرات، مگاکاریوسیت‌ها یا دیگر پیش‌سازهای هماتوپویتیک، نمونه باید به عنوان “blood tap” یا خون محیطی گزارش شود. در فقدان ذرات، اما در حضور مگاکاریوسیت‌ها یا دیگر سلول‌های پیش‌ساز، نمونه باید به عنوان مغزاستخوان رقیق شده diluteگزارش شود و یک ارزیابی کیفی انجام گردد. در حضور ذرات با تعداد کم سلولاریتی یا فقدان سلولاریتی فقط یک توصیف کیفی باید انجام شود. شمارش سلول‌های خونی بیمار و یک اسمیر خون محیطی رنگ شده با رنگ رومانوسکی باید همیشه همراه با اسلایدهای آسپیره بازبینی شود.
شمارش افتراقی سلول‌های هسته‌دار
شمارش افتراقی سلول‌های هسته‌دار مغزاستخوان (NDC) برای ارزیابی فعالیت خونسازی و برای مقایسه نسبت‌های رده‌های سلولی مختلف با محدوده مرجع شناخته شده و همچنین برای بررسی کمی سلول‌های غیرطبیعی باید انجام شود. NDC باید در دنباله‌های سلولی پشت ذرات اسمیر مغزاستخوان که مختصری با خون محیطی رقیق شده است شمارش شود. سلول‌های مغزاستخوان باید در ناحیه‌ای که سلول‌ها به خوبی پخش شده‌اند و جزئیات سیتولوژیکی خوبی دارند و جایی که حداقل سلول‌های شکسته شده یا لیز شده وجود دارد، شمارش شود.
NDC شامل سلول‌های بلاست، پرومیلوسیت‌ها، میلوسیت‌ها، متامیلوسیت‌ها، اشکال باند، نوتروفیل‌های چند هسته‌ای، ائوزینوفیل‌ها، بازوفیل‌ها، ماست‌سل‌ها، پرومنوسیت‌ها و منوسیت‌ها، لنفوسیت‌ها، پلاسماسل‌ها و اریتروبلاست‌ها است. NDC، مگاکاریوسیت‌ها، ماکروفاژها، استئوبلاست‌ها، استئوکلاست‌ها، سلول‌های استرومایی، سلول‌های شکسته شده یا سلول‌های غیرهماتوپویتیک مثل سلول‌های توموری متاستاتیک را دربر نمی‌گیرد. تجمعات لنفوئیدی، در صورتی که وجود داشته باشد، نباید در NDC گنجانده شود ولی وجودشان باید ذکر شود.
زمانی که درصد دقیق یک نوع سلول غیرطبیعی برای تشخیص ضرورت دارد حداقل 500 سلول در حداقل 2 اسمیر شمارش شود. اگر NDC برای تشخیص ضرورت ندارد حداقل 300 سلول شمارش شود. برای کاهش عدم دقت مربوط به خطای نمونه‌گیری در مواردی که تعداد سلول غیرطبیعی بسیار نزدیک به آستانه بحرانی طبقه‌بندی بیماری یا نزدیک به آستانه پایین (مثلاً 5%) باشد یا زمانی که شواهد پیشنهادکننده درگیری ناحیه‌ای مغز استخوان با سلول‌های غیرطبیعی باشد تعداد کل سلول‌های شمارش شده در NDC باید با شمارش در اسمیر دیگر یا شمارش توسط مشاهده‌گر دوم افزایش یابد. تعداد کل سلول‌های شمارش شده در NDC باید در گزارش بیان شود. تعداد به دست آمده باید با محدوده نرمال NDC در بزرگسالان یا در شیرخواران و بچه‌ها مقایسه شود.
نسبت میلوئید به اریتروئید (M:E) با بیان نسبت همه گرانولوسیت‌ها و منوسیت‌ها و پیش‌سازهای آنها (مثلاً میلوبلاست‌ها، پرومیلوسیت‌ها، میلوسیت‌ها، متامیلوسیت‌ها، اشکال باند، نوتروفیل‌های چندهسته‌ای، ائوزینوفیل‌ها، بازوفیل‌ها، پرومنوسیت‌ها و منوسیت‌ها) به اریتروبلاست‌ها (در تمام مراحل تمایز) محاسبه می‌شود. شمارش افتراقی فلوسیتومتری نباید به عنوان جایگزین برای NDC به دست آمده از اسمیر به کار رود. فلوسیتومتری و مورفولوژی روش‌های مکملی هستند که اطلاعات مختلف و ارزشمندی را به ما می‌دهد ولی درجه ارتباط اینها با یکدیگر بسیار متغیر است.
ذخیره آهن
رنگ‌آمیزی آبی پروس باید روی اسمیر مغز استخوان برای ارزیابی ذخیره آهن و سیدروبلاست‌ها انجام شود. یک اسمیر مغزاستخوان با افزایش ذخیره آهن باید به عنوان کنترل مثبت در نظر گرفته شود. رنگ‌آمیزی آهن روی همه آسپیره‌های اولیه مغزاستخوان باید انجام شود اما روی آسپیره‌های فالوآپ بیمار مثلاً برای لوکمی ضرورت ندارد. نمونه‌های له شده و برش‌های لخته ذره هم می‌تواند برای آهن رنگ شود. اگر آسپیره خشک (dry tap) داریم برش بیوپسی و نقش‌گذاری (imprint) برای آهن رنگ‌آمیزی می‌شود. برای ارزیابی ذخیره آهن برش‌های بیوپسی نسبت به آسپیره کمتر قابل اعتماد هستند زیرا دکلسیفیکاسیون ذخیره آهن را کاهش می‌دهد. برای ارزیابی آهن سیدروبلاست که می‌تواند در نقش‌گذاری بیوپسی شناسایی شود نباید از نمونه بیوپسی استفاده کرد. وجود یا فقدان ذخایر آهن با بررسی ماکروفاژهای مغزاستخوان در چندین ذره در اسمیر مغزاستخوان ارزیابی می‌شود. ذخایر آهن در اسمیرها به طریقه سابژکتیو گریدبندی می‌شود (به صورت فقدان، کاهش یافته، طبیعی، افزایش یافته یا بسیار افزایش یافته). تخمین کمی ذخایر آهن در معرض اختلاف‌نظر بین مشاهده‌کنندگان مختلف است و قابلیت تکرارپذیری ندارد.
تعداد کل سیدروبلاست‌ها (طبیعی، کاهش یافته یا افزایش یافته) و فراوانی و موقعیت (سیتوپلاسمیک یا اطراف هسته‌ای) گرانول‌های سیدروتیک، در صورتی که برای تشخیص لازم است، باید ذکر شود. در یک اسمیر رنگ شده با آهن، سیدروبلاست‌های حلقوی با وجود پنج یا بیشتر گرانول‌های سیدروتیک که یک سوم یا بیشتر هسته را احاطه می‌کند تعریف می‌شوند. حداقل 100 اریتروبلاست باید برای تعیین درصد سیدروبلاست‌های حلقوی ارزیابی شود.
بررسی‌های تکمیلی
بررسی‌های بیشتر شامل ایمونوفنوتایپینگ فلوسیتومتریک، سیتوشیمی، FISH و ژنتیک مولکولی می‌تواند روی آسپیره مغزاستخوان انجام شود. نتایج فلوسیتومتری باید با مرفولوژی و همچنین با IHC انجام شده روی نمونه هیستولوژیک بیمار انطباق داده شود. برای موارد مشکوک به لوکمی حاد، رنگ‌آمیزی سیتوشیمی برای میلوپراکسیداز و استراز غیراختصاصی (مثل آلفا-نفتیل بوتیرات استراز) توصیه می‌شود. این رنگ‌آمیزی‌ها در مواردی که نتایج فلوسیتومتری غیرقطعی است یا در دسترس نیست ارزشمند می‌باشد.
:Reference
S.-H. Lee, W. N. Erber, A. Porwit, M. Tomonaga, L. C. Peterson– For The International Council For Standardization In Hematology. ICSH guidelines for the standardization of bone marrow specimens and reports. Int. Jnl. Lab. Hem. 2008, 30, 349–364
رهنمودهای ICSH برای استانداردسازی نمونه‌ها و گزارش‌های مغز استخوان (1)
برای دانلود فایل pdf بر روی لینک زیر کلیک کنید
ورود / ثبت نام