سیستم HLA: ایمونوبیولوژی، تکنیک‌های HLA تایپینگ، آنتی‌بادی اسکیرینینگ و کراس مچ

سیستم HLA: ایمونوبیولوژی، تکنیک‌های HLA تایپینگ، آنتی‌بادی اسکیرینینگ و کراس مچ

لیلا خانی، کارشناس ارشد ایمونولوژی، دپارتمان HLA تایپینگ آزمایشگاه تخصصی نوبل

ساغر ذاکری، کارشناس ارشد ژنتیک، دپارتمان HLA تایپینگ آزمایشگاه تخصصی نوبل

 

آنتی‌ژن‌های لوکوسیت انسانی[1] (HLA) نقش اساسی در تنظیم پاسخ‌های ایمنی ایفا می‌کنند. سیستم HLA با پلی‌مورفیسم قابل توجهش، نقش بی‌همتایی در تنظیم پاسخ‌های ایمنی به ویژه در پاسخ‌های بالینی پیوند دارد. سیستم HLA دو خانواده ژنی پلی‌مورفیک را به طول 3600 کیلوجفت باز کد می‌کند و روی بازوی کوتاه (p21,3) کروموزوم 6 قرار دارد. ژن‌های کلاسیک HLA پلی‌مورفیک‌ترین ژن‌ها هستند که در هر لوکوس آنها تعداد زیادی واریانت آللی قرار دارد. ملکول‌های HLA گلیکوپروتئین‌های سطحی هستند که به پپتیدهای آنتی‌ژنی پردازش‌شده، متصل می‌شوند و آن‌ها را به سلول‌های T عرضه می‌کنند. وراثت ژنی این مجموعه شگفت‌انگیز ایمونولوژیک به صورت مندلی است. تمام آنتی‌ژن‌های به ارث رسیده به صورت هم‌بارز بیان می‌شوند. آنتی‌ژن‌های کلاس I شامل A، B و C است که بر سطح تمام سلول‌های هسته‌دار و پلاکت‌ها بیان می‌شود و در عرضه آنتی‌ژن‌های پردازش‌شده داخل سلولی (با منشأ داخلی یا ویروسی) به سلول‌های ⁺TCD8 دخیل هستند. طول این پپتیدها معمولاً 12-10 اسیدآمینه است. پلی‌مورفیسم‌های ژنی HLA I اغلب واریانت‌های آمینواسیدی ناحیه باندشونده به آنتی‌ژن را ایجاد می‌کنند که باعث ایجاد تنوع چشم‌گیری در ذخایر پپتیدهای متصل‌شونده به سلول‌های ⁺TCD8 می‌گردند. این سلول‌ها با شناسایی پپتیدهای غیرخودی یا خودی متصل‌شده به HLA فعال شده و نقش عملکردی خود را ایفا می‌کنند. اپی‌توپ‌های برخی از کلاس‌های ملکول HLA نیز می‌توانند به منزله لیگاندی برای سلــول‌های کشنده طبیعی (Natural Killer) باشند و اعمال این جمعیت سلولی را نیز تحت تأثیر قرار دهند.

ملکول‌های HLA II شامل DP، DQ و DR هستند که توسط انواع محدودی از سلول‌ها از جمله لنفوسیت‌های B، T فعال شده و رده مونوسیتی/ ماکروفاژی بیان می‌شود؛ البته برخی از دیگر جمعیت‌های سلولی نیز مانند سلول‌های اندوتلیال تحت تأثیر اینترفرون گاما و طی پاسخ‌های التهابی نیز ملکول‌های HLA II را بیان می‌کنند. این ملکول‌ها آنتی‌ژن‌هایی با منشأ خارجی را به سلول‌های ⁺TCD4 عرضه می‌کنند. این پپتیدهای خارجی حدوداً 25-14 آمینواسید طول دارند. پلی‌مورفیسم‌های ژن HLA II اغلب آمینواسیدهای متنوعی را در ناحیه اتصال به پپتیدهای خارجی کد می‌کنند که خود سبب افزایش دامنه پپتیدهای متصل‌شونده به سلول‌های ⁺TCD4 می‌شود. شناسایی این پپتیدها توسط این جمعیت سلولی منجر به فعال‌سازی آن و در نتیجه ترشح سایتوکاین می‌شود.

اهمیت بالینی ملکول‌های HLA در چند زمینه بیشتر مورد توجه قرار گرفته است که در این مقاله به دو مورد می‌پردازیم:

• ارتباط وجود آلل‌های خاصی از HLA و بروز بیماری‌ها
• اهمیت تطابق ملکول HLA در پیوند اعضا

تحقیقات حاکی از آن است که ارتباط قوی بین برخی از نواحی HLA و بیماری‌های خود ایمن وجود دارد. مطالعات متعددی به وجود یک ارتباط معنادار بین هاپلوتایپ کدکننده HLA-DRB1-DQA1-DQB1 و بروز چندین بیماری خود ایمن پی برده‌اند. ملکول‌های کدکننده این ناحیه ژنی نقش مهمی در عرضه آنتی‌ژن‌های خارجی به سلول‌های کمکی ⁺TCD4 دارد که تأکیدی بر اهمیت این مسیر در آغاز و پیشرفت بیماری‌های خود ایمن است. اگرچه ارتباط دیگر ملکول‌های سیستم ژنی HLA با بروز بیماری‌های خود ایمن بررسی شده است، به استثنای HLA-B27 که به شکل معناداری با بیماری اسپوندیلیت آنکلیزیون مرتبط است، اما به‌سختی می‌توان ارتباط لوکوس‌های مستقل از linkage disequilibrium با ژن‌های HLA II را در بروز بیماری‌های خود ایمن تأئید نمود.

در پیوند سلول‌های بنیادی، تطابق (matching) HLA دهنده و گیرنده پیوند اهمیت به‌سزایی دارد. در پیوند بافت‌های توپر، عدم تطابق (mismatch) منجر به بروز عواقب ناخوشایندی می‌شود. از این رو انجام تست‌های آزمایشگاهی پیش از پیوند می‌تواند نقش به‌سزایی در ممانعت از عواقب احتمالی عدم تطابق بین HLA دهنده و گیرنده داشته باشد. پاسخ‌های آنتی‌بادی علیه HLA غیرخودی بیان‌شده سطح عضو پیوندی منجر به پاسخ‌های فوق حاد، فوق حاد تأخیری و حاد می‌شود و همچنین می‌تواند در بروز آسیب بافتی آلوگرافت مزمن نیز مؤثر باشد. آنتی‌بادی‌های ضد HLA در نتیجه بروز حساسیت (بارداری، انتقال خون و سابقه پیوند) ایجاد می‌شوند. ایجاد آنتی‌بادی ضد HLA بافت پیوندی دهنده منجر به بروز پیش‌آگهی ضعیف در افراد می‌شود، به همین جهت بررسی مداوم آنتی‌بادی‌ها اهمیت به‌سزایی دارد. تمرکز اصلی ما در این مقاله بررسی و مقایسه انواع روش‌های سنجش HLA و آنتی‌بادی‌های علیه آن است.

 

تعیین تایپHLA  یا HLA Typing:

به طور کلی روش‌های متنوعی جهت HLA تایپینگ وجود دارد که شامل موارد ذیل می‌شوند: روش‌های سرولوژی و روش‌های ملکولی

روش‌های سرولوژی: در این روش ملکول های HLA بیان شده بر سطح سلول‌های B و T با استفاده از یک پنل آنتی سرم و با کمک کمپلمان بررسی می‌شود. این روش محدودیت‌های خاصی نیز دارد که می‌توان به لزوم استفاده از لنفوسیت زنده اشاره کرد. رزولوشن یا حساسیت این تست پایین‌تر از حد قابل قبول است و این خود تأئیدی بر لزوم استفاده از روش‌های ملکولی جهت انجام HLA تایپینگ در آزمایشگاه است.

روش‌های ملکولی: روش‌های مبتنی بر بررسی DNA مزایای قابل‌توجهی نسبت به روش‌های سرولوژیک دارد که شاید مهم‌ترین آن عدم نیاز به لنفوسیت زنده باشد. در ادامه به بررسی روش‌های ملکولی موجود می‌پردازیم:

 

تست PCR با استفاده از پرایمر های اختصاصی توالی یا

Sequence Specific Primers (SSP):

روش SSP با استفاده از پرایمرهای اختصاصی توالی به بررسی حضور گروه‌هــای آللی HLA می‌پردازد. SSP-PCR را می‌توان از جمله روش‌های ملکولی با حساسیت پائین دسته‌بندی نمود. در واقع تکنیک SSP وابسته به تکثیر DNA با استفاده از پرایمرهای اختصاصی آلل یا گروه آللی است که در نهایت می‌توان با شناسایی اندازه باند قطعات تکثیر شده و با استفاده از ژل الکتروفورز به بررسی نتایج تست پرداخت.

 

تست PCR با پروب‌های اولیگونوکلئوتیدی اختصاصی توالی یا

Sequence Specific Oligonucleotide Probes (SSOP):

این روش مبتنی بر پروب‌های DNA اولیگونوکلئوتیدی سنتز شده و سپس هیبریداسیون آن به قطعات حاصل از تکثیر با PCR است، به طوری که در هر لوکوس چندین پروب اولیگونوکلئوتیدی بررسی می‌شود. در این روش پنل پروب‌های موجود به توالی‌های هدف مکملش که حاصل تکثیر DNA است، متصل می‌گردد. پروب‌ها ممکن است با استرپتاویدین کونژوگه به آنزیم (مانند HRP) نشانه‌گذاری شده باشند و این هیبریداسیون با استفاده از سوبستراهای کروموژن یا کمولومینسانس شناسایی می‌شود. مبنای این روش در شناسایی تایپ HLA هر فرد وابسته به استفاده از یک پنل از پروب‌های اختصاصی است که قابلیت اتصال به توالی آلل اختصاصی DNA تکثیریافته را دارند.

 

تایپینگ بر مبنای توالی‌یابی Sequence-based typing (SBT):

SBT به عنوان کامل‌ترین روش در تایپینگ آلل‌های HLA قلمداد می‌شود. علاوه بر این، SBT به علت رزولوشن بالا روشی کارآمد در بررسی و تأئید توالی آلل‌های جدید است. SBT مبتنی بر تکثیر لوکوس- یا گروه اختصاصی از اگزون‌های پلی‌مورفیک است و در مرحله بعد تمام این قطعات توالی‌یابی می‌شوند.

 

شناسایی و بررسی آنتی‌بادی‌های ضد HLA:

نقش پاتوژنیک آنتی‌بادی‌ها در رد پیوند فوق حاد به خوبی بررسی و تأئید شده است. حضور این آنتی‌بادی‌ها با استفاده از روش‌های زیر بررسی می‌شود:

 

روش سایتوتوکسیسیتی وابسته به کمپلمان یا

 :complement-dependent cytotoxicity (CDC)

این تکنیک مبتنی بر لنفوسیت‌های زنده است. برای بررسی آنتی‌بادی ضد HLA I، سلول‌های T و جهت بررسی HLA II نیز سلول‌های B بررسی می‌شوند. تست کراس مچ به روش CDC را نیز می‌توان با افزودن DTT انجام داد که در این صورت آنتی‌بادی‌های IgM تجزیه خواهند شد و در نتیجه تست مثبت فقط ناشی از عملکرد IgG خواهد بود. بایستی به این نکته توجه نمود که حذف پاسخ‌های IgM اقدام مناسبی به نظر نمی‌رسد؛ چرا که بسیاری از آلواتوآنتی‌بادی‌ها از جنس IgM هستند و در نظر نگرفتن این کلاس آنتی‌بادی می‌تواند موفقیت‌آمیز بودن پیوند را با تردید روبه‌رو کند. در این روش تنها آنتی‌بادی‌هایی که قادر به فیکس کردن کمپلمان هستند شناسایی می‌شوند. این روش به نسبت زمان‌بر است و از حساسیت کافی برخوردار نیست. تکنیک فلوسیتومتری که تکنیکی حساس‌تر است، امکان بررسی آنتی‌بادی‌های غیرفیکس‌کننده کمپلمان را نیز فراهم آورده است. هرچند این تکنیک‌ها در بررسی بیمارانی که قبلاً به MHC I & II حساس شده‌اند، مناسب نیست.

 

غربالگری آنتی‌بادی‌های ضد HLA با استفاده از الایزا:

این روش مزایایی نسبت به روش‌های مبتنی بر سلول دارد که عبارتند از عدم نیاز به نمونه سلولی زنده، امکان بررسی آنتی‌بادی‌های فیکس‌کننده و غیرفیکس‌کننده کمپلمان، امکان گزارش نتایج به صورت نیمه کمی و البته سرعت آن. لازم به ذکر است در این بررسی‌ها تنها آنتی‌بادی‌های ضد HLA شناسایی می‌شوند. عمده‌ترین مزیت الایزا امکان بررسی تعداد زیادی نمونه بیمار در مدت زمانی نسبتاً کوتاه است. علاوه بر این، می‌توان به وجود امکان بررسی اختصاصیت HLA II و HLA I نیز اشاره کرد. اگرچه حساسیت الایزا نسبت به روش CDC بالاتر است، اما نسبت به بررسی‌های فلوسیتومتری/لومینکس کمتر است.

 

غربالگری و بررسی آنتی‌بادی‌های ضد HLA به وسیله تکنیک‌های فلوسیتومتری/X-Map:

این روش اخیراً، به عنوان گلد استاندارد شناسایی آنتی‌بادی‌های ضد HLA مطرح شده است، این روش مبتنی به استفاده از ملکول‌های HLA محلول یا نوترکیب‌شده متصل به ذرات پلی‌استرن هستند. بررســی X-Map (لومینکس) در واقع به شناسایی ذرات پلی‌استر رنگ‌شده با دو فلورکروم مختلف می‌پردازد. بیدها به مخلوطی از آنتی‌ژن‌های HLA متصلند و سپس با سرم بیمار مجاور می‌شوند. آنتی‌بادی ثانویه انسانی به ملکول ریپورتر متصل می‌شود و سپس به مخلوط واکنش اضافه می‌شود. دستگاه فلوسیتومتر با بررسی نیمه کمی به بررسی مقدار آنتی‌بادی می‌پردازد. بررسی‌های فلوسیتومتری و لومینکس را می‌توان برای غربالگری و شناسایی در فرمت‌های مختلف استفاده کرد. با استفاده از لومینکس می‌توان هر دو گروه آنتی‌بادی فیکس‌کننده و غیرفیکس‌کننده کمپلمان را شناسایی نمود. تکنیک لومینکس قابلیت شناســایی مستقل HLA II و HLA I را دارد. می‌توان از تست‌های لومینکس فلوسیتومتری یا بیدهای فلوسیتومتری جهت بررسی عدم تطابق HLA استفاده کرد. تکنیک‌های شناسایی آنتی‌بادی امکان بررسی آنتی‌بادی‌های ضد HLA را در دریافت‌کنندگان پیوند فراهم می‌آورد. علاوه بر این، فلوسیتومتری قابلیت شناسایی آنتی‌بادی‌هایی را ایجاد می‌کند که در تکنیک‌های قبلی قابل تشخیص و بررسی نبودند.

 

کراس مچ گیرنده-دهنده:

وجود آنتی‌بادی علیه آنتی‌ژن‌های دهنده پیوند در سرم گیرنده منجر به وقوع رد پیوند فوق حاد می‌شود. بایستی قبل از انجام پیوندهای توپر، تست کراس مچ انجام شود. این تست به یک یا دو روش انجام می‌شود که عبارتند از سیتوتوکسیسیتی وابسته به کمپلمان (CDC) و فلوسیتومتری. انجام این دو روش در کنار هم می‌تواند بسیار مفید واقع شود، چرا که هر تست به بررسی آنتی‌بادی‌های مختلفی می‌پردازد.

 

کراس مچ با روش فلوسیتومتری

انجام تست کراس مچ با روش فلوسیتومتری حساسیت بسیار بالاتری نسبت به روش CDC دارد. در این روش لنفوسیت‌های دهنده با سرم گیرنده انکوبه شده و پس از شست‌وشو به آن آنتی‌بادی anti-human لیبل‌شده با فلوروکروم اضافه می‌شود. جهت بررسی لنفوسیت‌های B و T نیز بایستی یک آنتی‌بادی مونوکلونال دیگر استفاده شود؛ در نهایت پس از شست شو با استفاده از دستگاه فلوسیتومتر میزان وجود آنتی‌بادی ضد دهنده در سرم گیرنده بررسی خواهد شد. بررسی فلوسیتومتری کراس مچ یک روش کارآمد در شناسایی آنتی‌بادی‌های IgG است؛ این روش مناسب بررسی IgM نیست. بررسی‌های پیشین نشان داده که ممکن است علیرغم منفی بودن CDC، بررسی کراس مچ به روش فلوسیتومتری مثبت باشد که البته نشانگر وجود آنتی‌بادی‌های ضعیف است.

 

کراس مچ با استفاده از روش‌های فاز جامد

روش‌های CDC و فلوسیتومتری محدودیت‌های خاصی از جهت نیاز آن به وجود سلول‌های زنده دارد، علاوه بر این در این سیستم‌ها ممکن است آنتی‌بادی‌های مونوکلونال منجر به ایجاد نتایج مثبت کاذب شوند. سیستم بید مولتیپلکس روش جدیدتری است که امکان بررسی آنتی‌بادی‌های ضد HLA دهنده پیوند را فراهم می‌کند.

 

منابع:

1. Rajalingam, Raja, Michael Cecka, and Elaine F. Reed. “Molecular HLA typing methods used in clinical laboratories.” Molecular Diagnostics(2010): 367-379.
2. Liu, Ping, et al. “Benchmarking the Human Leukocyte Antigen Typing Performance of Three Assays and Seven Next-Generation Sequencing-Based Algorithms.” Frontiers in Immunology12 (2021): 840.‏
3. Howell, W. M., V. Carter, and B. Clark. “The HLA system: immunobiology, HLA typing, antibody screening and crossmatching techniques.” Journal of clinical pathology63.5 (2010): 387-390.‏
4. Duquesnoy, Rene J. “Reflections on HLA epitope-based matching for transplantation.” Frontiers in immunology7 (2016): 469.‏

1Human Leukocyte Antigen

پرسش و پاسخ‌های آزمایشگاهی و کاربردی در طب انتقال خون (2)

پرسش و پاسخ‌های آزمایشگاهی و کاربردی در طب انتقال خون (1)

واکنش‌های نامطلوب تزریق خون در نگاه میکروسکوپی

برای دانلود فایل pdf  بر روی لینک زیر کلیک کنید