فناوری ریزآرایه DNA

فناوری ریزآرایه DNA

محمدرضا صفري¹ – ريحانه صريحي²

1: دکترای بیوشیمی

2: کارشناس علوم آزمایشگاهی

مقدمه

همانطور که می‌دانیم عملكرد اصلي سلول‌ها در بدن توليد پروتئين است؛ به‌عنوان يك اصل سلول‌ها در شرايط مختلف پروتئین‌های متفاوتي می‌سازند. از طرفي توليد پروتئين رابطه مستقيمي با ميزان بيان ژن‌ها دارد، يعني در حالات متفاوت، سلول‌ها مقدار معيني از mRNA را بيان می‌کنند، لذا بررسی بیان ژن‌ها در شرایط مختلف می‌تواند در زمینه‌ی کشف روندهای داخل سلولی بسیار مفید واقع شود.

پس از خاتمه طرح ژنوم انساني و تعيين رديف كامل ژنوم انسان، دانشمندان بیش از پیش به مطالعه در زمینه‌ی بیان ژن‌ها علاقه‌مند شدند. در ابتدا بیشتر بررسی‌ها در زمینه‌ی بیان ژن‌ها به‌صورت بررسی یک یا حداکثر چند ژن انجام می‌شد اما ابداع تکنیک DNA میکرواری سبب وقوع انقلابی در این بررسی‌ها شد. مزیت این تکنیک در قابلیت آن برای بررسی همزمان هزاران ژن به‌طور هم‌زمان بود. درواقع بررسی‌ها نشان داده بود که مطالعه يك ژن و يا يك پروتئين و كشف يك فرايند به‌طور جداگانه كمك بسياري به کشف فرایندهای داخل سلولی نمی‌کند، زيرا فرایندهای زيستي بسيار پيچيده است و گاهي ده‌ها و صدها ژن در بروز يك فعاليت نقش دارند و این امر سبب شد که تکنیک DNA میکرواری به‌عنوان یکی از جدیدترین متدهای روز در دنیا مطرح شود، به‌طوری‌که در سال گذشته شماره مخصوصي از مجله ژنتيك ” نيچر” و مجله” بيوتكنيك” به توضيح DNA میكرواري اختصاص داده شده است.

1- فناوری ریزآرایه DNA

واژه‌ی DNAmicroarray خود از سه بخش تشکیل شده است: DNA و micro و array. DNA یا همان دزوکسی ریبونوکلئوتید، میکرو به هر جسم کوچک اطلاق می‌شود و array یک سطح شیشه‌ای، پلاستیکی یا از جنس سیلیکون است که در واقع همان سطح اصلی واکنش را برای ما فراهم می‌کند که اصطلاحاً به آن DNA chip یا micro chip هم گفته می‌شود. در سطح این array یکسری نقاط تحت عنوان spot طراحی شده است که درواقع هر یک از این spotها همان محلی هستند که واکنش اصلی در آن‌ها رخ می‌دهد (۶).

2- اساس تکنیک ریزآرایه DNA

اساس تکنیک ریزآرایه DNA در واقع همان واکنشی است که در spotها رخ می‌دهد. در سطح micro chipها و در داخل هر یک از spotها که پیش از این در مورد آن صحبت کردیم توالی‌هایی تحت عنوان کاوشگر کد شده است که در واقع توالی این کاوشگر از نظر ساختار نوکلئوتیدی مکمل توالی هدفی است که ما در نمونه به دنبال آن هستیم (۷).

اساس واکنش توالی هدف و کاوشگر کدشده در داخل spotها همان واکنش هیبریداسیون بین دو رشته‌ی DNA است. می‌دانیم که اساس واکنش هیبریداسیون بین دو رشته‌ی DNA برقراری پیوند هیدروژنی بین بازهای آلی نیتروژن‌دار در دو رشته‌ی DNA است. پیوندهای هیدروژنی جزو پیوندهای واندروالس و ضعیف هستند، بنابراین هرچه تعداد آن‌ها بیشتر باشد اتصال بین دو رشته محکم‌تر است و لذا توالی‌های کاوشگر و هدف به‌صورت محکم‌تری به یکدیگر متصل می‌شوند و به‌راحتی و در اثر شستشو جدا نمی‌شوند (۷) (۹).

شکل 1: ساختار arrray و کاوشگرهای کدشده بر آن

3– ساختار spotها

پیش آن این گفته شد که توالی‌های کاوشگر در سطح micro chipها و در داخل spotها کد شده‌اند؛ در حقیقت در این تکنیک ما می‌توانیم هزاران توالی مختلف را در داخل این spotها کد کنیم و درواقع همین ویژگی است که به این تکنیک این توانایی را می‌دهد که به‌طور هم‌زمان هزاران ژن را مورد ارزیابی قرار دهد، به همین منظور توالی‌های کاوشگر در داخل spotها با نظم خاصی قرار داده شده‌اند. نحوه‌ی قرارگیری توالی‌های هدف در داخل spotها به گونه‌ای است که در داخل هر spot از یک توالی به تعداد متعدد و در spotهای مختلف توالی‌های گوناگون کد شده‌اند. در ادامه‌ی توضیح خواهیم داد که چگونه این نحوه‌ی قرارگیری می‌تواند در آنالیز داده‌ها کمک‌کننده باشد (۷).

یک نکته‌ی قابل‌توجه در این مبحث آن است که توالی‌های هدف باید در داخل spotها به‌صورت تک‌رشته قرار گیرند تا در صورت حضور توالی هدف بتوانند به‌سرعت با آن جفت شوند.

4- اساس ردیابی واکنش

گفتیم که اساس واکنش در این تکنیک اتصال دو توالی کاوشگر و هدف است که توالی کاوشگر در داخل spotها و توالی هدف در داخل نمونه است. در واقع وقوع یا عدم وقوع این اتصال نشان‌دهنده‌ی حضور یا عدم حضور توالی هدف در داخل نمونه است که ما در این تکنیک به دنبال ردیابی آن هستیم، بنابراین ما باید به نحوی وقوع این واکنش را مشخص کنیم (۵).

در این تکنیک ما با استفاده از نشاندار کردن توالی هدف با استفاده از ماده‌ی فلورسانس، وقوع واکنش را ردیابی می‌کنیم؛ در حقیقت با نشاندار کردن توالی هدف در صورت وقوع واکنش و در صورتی که اتصال بین دو رشته به‌اندازه‌ی کافی محکم باشد تا در اثر شستشو جدا نشوند، ما با ردیابی ماده‌ی فلورسانس می‌توانیم به وقوع واکنش پی ببریم (۵).

5- توالی هدف چیست؟

تکنیک ریزآرایه‌های DNA تکنیکی است برای ارزیابی بیان ژن از جنبه‌های زیر:

۱– بیان یا عدم بیان ژن (کیفی)

۲– میزان بیان ژن (به‌صورت نسبی)

۳– مقایسه‌ی بیان ژن بین دو سلول (دو سلول متفاوت، سلول‌های بیمار و سالم و …..)

بنابراین هدف ما در این تکنیک بررسی و مطالعه‌ی ژن‌هایی است که بیان می‌شوند و به این منظور مناسب‌ترین نمونه mRNA سیتوپلاسمی است؛ یعنی RNAی پیامبری که پس از رونویسی تحت ویرایش قرار گرفته و سپس به‌منظور انجام ترجمه از هسته خارج شده است.

استفاده از mRNA سیتوپلاسمی دارای دو مزیت است: ۱- حذف اینترون‌ها ۲- بررسی ژن‌هایی که رونویسی و در واقع بیان شده است. از روی این mRNA سیتوپلاسمی و توسط آنزیم رونوشت‌بردار معکوس یک cDNA یا DNAی مکمل به‌صورت تک‌رشته ساخته می‌شود که این cDNA درواقع همان توالی هدف است (۳).

6- چرا cDNA؟

استفاده از cDNA دارای دو علت است:

۱– DNA بسیار پایدارتر از RNA است‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌، لذا احتمال تخریب آن در طی مراحل آزمایش بسیار کمتر است.

۲– نشاندار کردن توالی cDNA در حین رونویسی معکوس با استفاده از بکارگیری نوکلئوتیدهای نشاندار (۴).

7- مراحل تکنیک

بايد طبق مراحل زير عمل كرد:

۱- نمونه‌گیری (خون)

۲- خالص‌سازی نمونه و جداسازى mRNAها

۳- انجام رونويسى معكوس و تهيه cDNA

۴- متصل كردن cDNA به رنگ‌های فلوئورسنت مانند cy3 (اگر بخواهیم مقایسه‌ی بین دو سلول را انجام دهیم در این مرحله از دو رنگ متفاوت برای سلول‌های متفاوت استفاده می‌کنیم که معمولاً از رنگ سبز برای سلول سالم یا کنترل و از رنگ قرمز برای سلول بیمار یا مورد آزمایش استفاده می‌کنیم.)

۵- ريختن محلول بر روى سطح ریزآرایه كه از قبل توسط توالی‌های ژن موردنظر پوشيده شده است، مدتى صبر می‌کنیم تا هيبريداسيون ميان cDNAها وتوالی‌هاى سطح ريزآرایه انجام گيرد.

۶– شستشو (جهت حذف توالی‌هایی که اتصال نیافته‌اند یا اتصالشان سست است).

۷- بررسى و پردازش نتايج (۱۱)

شکل 2: مراحل انجام آزمایش

8- میکروسکوپ اسکن‌کننده‌ی لیزری یا دستگاه اسکنر microarray

پس از خاتمه مراحل دورگه‌سازی يا هيبريداسيون نمونه با ریزآرایه، نتايج با دستگاه اسكنر خوانده می‌شود. دستگاه اسكنر به لیزرهای با طول‌موج مختلف برای رنگ‌های مختلف مجهز است كه سطح لام را به‌طور رج‌زدن و بسيار دقيق و نقطه‌به‌نقطه بررسي كرده و نتيجه را به شكل يک تصوير از مقايسه نمونه‌های شاهد با نمونه بيمار ارائه می‌دهد؛ در واقع دستگاه تصاویر ناشی از بررسی نمونه‌ی سالم و بیمار را همپوشانی می‌دهد و تصویر ناشی از این همپوشانی است که جهت آنالیز نتایج مورداستفاده قرار می‌گیرد.

نتايج بر اساس 2 معيار رنگ و شدت رنگ در مقايسه با استانداردها ارائه می‌شود. هر رنگ داراي معناي خاص و شدت آن نيز داراي مفهوم مشخصي است (۱۰).

شکل 3: اساس کار دستگاه

9- بررسی نتایج

آنالیز نتایج مربوط به این تکنیک از طریق بررسی تصویر نهایی که دستگاه اسکنر به ما می‌دهد انجام می‌شود. در این تصویر ۴ رنگ اصلی وجود دارد که هر یک دارای مفهومی است:

رنگ سبز: نشان‌دهنده‌ی آن است که توالی موردنظر فقط در سلول سالم یا کنترل بیان می‌شود.

رنگ قرمز: نشان‌دهنده‌ی آن است که توالی موردنظر فقط در سلول بیمار یا مورد آزمایش بیان می‌شود.

رنگ زرد: نشان‌دهنده‌ی بیان توالی موردنظر در هر دو سلول سالم و بیمار است.

رنگ مشکی: نشان‌دهنده‌ی آن است که توالی موردنظر در هیچ‌یک از سلول‌ها بیان نشده است.

به‌علاوه شدت رنگ‌گیری هر یک از نقاط بیانگر میزان نسبی بیان هر یک از توالی‌ها می‌باشد به این صورت که شدت رنگ بیشتر نشان‌دهنده‌ی بیان بیشتر توالی موردنظر است (۲).

شکل 4: تصویر نهایی بدست‌آمده از دستگاه اسکنر لیزری

10- مزایا

مهم‌ترین و اصلی‌ترین مزیت این روش قابلیت بررسی همزمان هزاران ژن است که این قابلیت موجب شد ماهیت بسیاری از فرآیندهای زیستی و بیماری‌هایی که چندین ژن به‌طور هم‌زمان در آن نقش دارند کشف شود. به‌علاوه این قابلیت سبب شد سرعت آنالیزها به‌شدت افزایش یابد (۸).

قابلیت دیگر این تکنیک که سبب شد استفاده از این تکنیک به‌سرعت افزایش یابد توانایی مقایسه‌ی بیان ژن بین سلول‌ها توسط این تکنیک بود که از این قابلیت در بررسی تکامل جانداران، بررسی سرطان‌ها و بیماری‌های چندژنی، بررسی اثر میکروارگانیسم‌های داخل سلولی بر عملکرد سلول و ….. استفاده می‌شود (۱۱).

11- معایب

با توجه به آنچه تاکنون گفته شد، بیان ژن و تولید RNA معمولاً به تولید پروتئین منجر می‌شود و تکنیک ریزآرایه‌ی DNA نیز بر پایه‌ی همین اصل ایجاد شده است، اما حقیقت آن است که این روند همیشه به این صورت پیش نمی‌رود و در برخی اختلالات علی‌رغم تولید mRNA، این تولید منجر به تولید پروتئین نمی‌شود، لذا با وجود آنکه در نتیجه‌ی آزمایش بیان ژن مثبت در نظر گرفته می‌شود اما در حقیقت پروتئینی تولید نمی‌شود و لذا عملکرد و فعالیت ناشی از آن پروتئین نیز در سلول وجود ندارد.

دانشمندان برای رفع این نقص از تکنیکی به نام آنالیز بیان پروتئین استفاده می‌کنند که این تکنیک درواقع تولید یا عدم پروتئین را مشخص می‌کند (۴) (۱).

Reference:

1. Tang YC, Wan G. DNA-directed assembly of protein microarrays. Front Biosci. 2008 May 1;13:5755-71.
2. Comparative environmental genomics in non-model species: using heterologous hybridization to DNA-based microarrays. J Exp Biol. 2007
3. Harnessing the power of gene microarrays for the study of brain aging DNA Alzheimer’s disease: statistical reliability DNA functional correlation. Ageing Res Rev. 2005
4. Microarray expression profiling: analysis DNA applications. CurrOpin Drug DiscovDevel. 2003
5. Gracey AY, Cossins AR. Application of microarray technology in environmental DNA comparative physiology. Annu Rev Physiol. 2003;65:231- 59. Epub 2002 May 1.
6. Lovmar L, et al (2003) Quantitative evaluation by minisequencing DNA microarrays reveals accurate multiplexed SNP genotyping of whole genome amplified DNA. Nucleic Acids Res 31:e129.
7. Wang D, et al (2003) Viral discovery DNA sequence recovery using DNA microarrays. PLoSBiol 1:257–60.
8. Lodish, 2013, microarray, molecular cell biology, W.H. freeman DNA company,newyork, fifth edition, pg. 237-239
9. Dubey C. R, 2008, DNA Chips, A textbook for Biotechnology, S. ChDNA DNA Company Ltd., New Delhi, 13th Edition, Pg. 194 – 197.
10. S.M. hoseini, et al, introduction to genetic testing – applications, advantages DNA disadvantages, genetics in third millennium, ( 2014 )

۱۱. علی کرمی، کاربردهای فناوری نوین سیستم ریزآرایه‌های ژنی و پروتئینی میکروآری در پزشکی و علوم پایه، زمان تحول، 1385، صفحه ۱۲-۱۵

مروری برفناوری ریزآرایه (Micro array)

رمزینه‌گذاری DNA

برای دانلود فایل pdf  بر روی لینک زیر کلیک کنید