بیماری‌های خون (Blood Disorders)

بیماری‌های خون (Blood Disorders)

2 پانل جدید برای تشخیص بیماری‌های خونی شایع و غیر شایع

دکتر میرمجید مصلائی

 نکات برجسته تست

• پانل جدید برای ناهنجاری‌های خونی شایع شامل آزمایش بیماری فون ویلبرند (von Willebrand)، نقص فاکتور 8، نقص فاکتور 9 و نقص فاکتور 11
• پانل جدید برای ناهنجاری‌های غیر شایع خونی شامل آزمایش نقص فاکتور 2، نقص فاکتور 5، نقص فاکتور 7، نقص فاکتور 10، دیس فیبرینوژنومی و غربالگری برای نقص/ بازدارنده فاکتور 13

 پیشینه بالینی

• برخی از ناهنجاری خونی وراثتی شایع هستند، در حالی که باقی بیماری‌ها به طور قابل توجهی نادر می‌باشند.
• شرایط اکتسابی مانند نقص ویتامین K، درمان وارفارین، بیماری‌های کبدی و انعقاد داخل عروقی منتشر، اغلب با نواقص فاکتورهای مختلف در ارتباط هستند.

الگوی وراثت	شیوع	نقص یا کمبود
اتوزومال غالب	1 در 100	بیماری فون ویلبرند
مغلوب وابسته به X	1 در 5000-4000 مرد	نقص فاکتور 8
مغلوب وابسته به X	1 در 30000 مرد	نقص فاکتور 9
اتوزومال مغلوب	1 در 100هزار- 1میلیون، 1 در 200 در میان جمعیت یهودی‌های اشکنازی	نقص فاکتور 11
اتوزومال مغلوب	1 در 2-1 میلیون	نقص فاکتورهای 2، 5، 10، و 13
اتوزومال مغلوب	1 در 500000	نقص فاکتور 7
اتوزومال غالب	ناشناخته،  نادر	دیس فیبرینوژنمی

• تست‌های زمان پروترومبین (PT) و زمان نسبی ترومبوپلاستین (aPTT)، می‌توانند راهنمای آزمایش ابتدایی برای ناهنجاری‌های وراثتی خون باشند، اگرچه به دلیل ناهمگونی بیمار و تنوع در حساسیت واکنشگرها، استثناهایی رخ می‌دهد.

بیماری‌های خونی	نتایج تیپیک PT و PTT
نقص فاکتورهای 8، 9 و 11، برخی موارد بیماری فون ویلبرند	PTT طولانی مدت جدا شده
نقص فاکتور 7	PT طولانی مدت جدا شده
نقص فاکتورهای 2، 5، و 10، برخی مــــوارد دیس فیبرینوژنمی	PT و PTT طولانی مدت
بسیاری از موارد بیماری فون ویلبرند، نقص فاکتور 13، برخی موارد دیس فیبرینوژنمی	PT و PTT نرمال

موارد درخواست آزمایش

• این تست‌ها برای کار اولیه بر روی بیماران مشکوک به ناهنجاری‌های خونی مناسب هستند.
• تظاهرات بالینی، سابقه خانوادگی، نتایج آزمایش‌های پایه کوآگولاسیون مانند PT و PTT و ترکیب مطالعات می‌تواند برای هدایت مناسب انتخاب تست، مورد استفاده قرار گیرند.
• آزمایش‌های فون ویلبراند شامل پانل ناهنجاری‌های رایج خونی می‌شوند که به عنوان تست‌های خط مقدم برای این بیماری توصیه می‌شوند.
• برای تشخیص یا تعیین زیر گروه، آزمایش‌های بیشتری می‌تواند مورد نیاز باشد.

تفسیر

• بازه‌های مرجع برای فعالیت‌های فاکتور، اغلب میان بچه‌ها و بزرگسالان متفاوت است؛ بازه‌های مرجع متناسب با سن، در جایی که قابل اجراست، ارائه خواهد شد.

محدودیت‌های آزمایش

• تست‌هایی که در این پانل وجود دارند، به دلیل یک اتوآنتی‌بادی اکتسابی (به استثناء تست فاکتور 13، که یک تست غربالگری برای نقص یا بازدارنده فاکتور 13 است)، میان نقائص وراثتی و اکتسابی تمایز قائل نمی‌شوند. در برخی از موارد، تست‌های بیشتر مانند آزمایش‌های بتسدا (Bethesda) می‌تواند شاخص باشد.
• آزمایش فاکتور 13 که در پانل ناهنجاری‌های نادر خونی قرار دارد (فاکتور 13، کیفی، در بازتاب نسبت به فاکتور 13، مخلوط 1 :1)، یک تست غربالگری کیفی است که نمونه‌های دارای نقص حاد فاکتور 13 را (کمتر از 1 درصد فعالیت نرمال) شناسایی می‌کند. نمونه‌هایی که شدت نقص آنها کمتر است، شناسایی نمی‌شوند. اگر در آزمایش ابتدایی لیز لخته رخ دهد، تست با استفاده از میکس 1:1 پلاسما بیمار و پلاسمای نرمال مخلوط تکرار می‌شود تا نقص فاکتور 13 از بازدارنده فاکتور 13 تشخیص داده شود. آزمایش کمی فاکتور 13 برای تأیید نتایج غیرعادی توصیه می‌شود.
• وجود هپارین می‌تواند با آزمایش‌های فاکتورهای 8، 9، و 11 تداخل داشته باشد.
• وجود یک بازدارنده مستقیم ترومبین می‌تواند با آزمایش‌های فیبرینوژن و فاکتورهای 2، 5، 7، 8، 9، 10 و 11 تداخل داشته باشد.
• دلایل دیگر خونریزی مانند اختلال عملکرد کیفی پلاکت و ناهنجاری‌های فیبرینولیتیک، شناسایی نخواهند شد.

مواد و روش‌ها

• شناسایی مکانیکی الکترومغناطیسی لخته (فیبرینوژن، فاکتور 2، 5، 7، 8، 9، 10، 11)
• ایمونواسی میانجی‌گری شده توسط ذرات میکرولاتکس جهت بررسی آنتی‌ژن فون ویلبراند (vWF آنتی‌ژن)
• آگلوتیناسیون پلاکتی
• حلالیت لخته (فاکتور 13)
• ایمونودیفیوژن شعاعی (آنتی‌ژن فیبرینوژن)

آزمایش‌های مرتبط

• زمان پروترومبین
• آزمایش بازدارنده، PT با انعکاس به مخلوط 1:1 PT
• زمان نسبی ترومبوپلاستین
• آزمایش بازدارنده، PTT با انعکاس به مخلوط 1:1 PTT، در انعکاس به انکوباسیون 1 ساعته
• فعالیت فاکتور 8
• هموفیلی  آ (F8) دو وارونگی در انعکاس به تعیین توالی و در انعکاس به حذف/ دوپلیکاسیون
• هموفیلی  آ (F8) دو وارونگی
• هموفیلی آ (F8) دو وارونگی، کشنده
• هموفیلی آ (F8) حذف/ دوپلیکاسیون
• تعیین توالی هموفیلی آ (F8)
• آنتی‌ژن فاکتور فون ویلبرند
• فعالیت فاکتور فون ویلبرند
• پانل فون ویلبرند
• پانل مولتی‌متریک فون ویلبرند
• فاکتور مولتی‌متریک فون ویلبرند
• فعالیت فاکتور 8 در انعکاس به تست بتسدای کمی، فاکتور 8
• فعالیت فاکتور 9
• تعیین توالی هموفیلی B

 رفرانس‌ها:

1. Friedman KD, Rodgers GM. Inherited coagulation disorders. In wintrobe’s clinical hematology, 12th ed. Greer JP, et al, eds. 2009 Philadelphia: Lippincott Williams and Wilkins, 1379–424.
2. Nichols WL, et al. Von Willebrand disease (VWD): evidencebased diagnosis and management guidelines, the National Heart, Lung, and Blood Institute (NHLBI) Expert Panel report (USA). Haemophilia 2008;14(2):171–232.
3. Verbruggen B, et al. Diagnosis of factor VIII deficiency. Haemophilia 2008;14 Suppl 3:76–82.
4. Hsieh L, Nugent D. Factor XIII deficiency. Haemophilia 2008;14:1190–1200.

کم‌خونی دیاموند بلک‌فان (Diamond- Blackfan anemia)

برای تشخیص بیماری و ناقل بودن بیماری کم‌خونی دیاموند بلک‌فان

       مروری بر بیماری

• کم‌خونی دیاموند بلک‌فان (DBA)، معمولاً به همراه کم‌خونی هیپوپلاستیک در مراحل اولیه نوزادی ظاهر می‌شود. آزمایش هماتولوژی، ماکروسیتوز و کاهش در تعداد پیش‌سازهای اریتروئیدی را نشان می‌دهد. حداقل 40% از کودکان مبتلا، به آنومالی یا ناهنجاری‌های وراثتی شامل بدریختی شست و اعضای فوقانی بدن، نقائص قلبی و عقب افتادگی جسمی و رشدی، همچنین ناهنجاری‌های سر و صورت که شامل شکاف کام و لب می‌شود، مبتلا هستند.
• افراد درگیر این بیماری، ریسک بالایی برای ابتلا به لوسمی دارند.
• DBA همچنین تحت عنوان کم‌خونی دیاموند بلک‌فان، سندرم Aase، سندرم Aase-Smith II و آپلازی وراثتی سلول قرمزخالص نیز شناخته می‌شود.

 ژنتیک

• اتوزومال غالب با تظاهر و بیان متفاوت
• نقایصی در بیش از 9 پروتئین ریبوزومی متفاوت شناخته شده‌ است.
• این تست 3 ژن پروتئین ریبوزومی متفاوت که به صورت رایجی درگیر هستند را بررسی می‌کند: RPS19 ,RPL5 RPL11

موارد درخواست آزمایش

• تأیید یک تشخیص بالینی
• مشاوره ژنتیک
• شناسایی موارد بسیار خفیف یا از نظر بالینی خاموش
• تأیید عدم بیماری یک اهدا کننده بالقوه پیوند سلول‌های بنیادی خون‌ساز

 نکات بیشتر در مورد درخواست آزمایش

• این تست برای تشخیص پیش از تولد یا زمانی که یک جهش فامیلی شناخته شده وجود دارد، مناسب نیست.

تفسیر آزمایش

• سه نتیجه ممکن این آزمایش ژنتیکی عبارتند از مثبت، منفی و گونه اهمیت بالینی ناشناخته یا VUS.
• تشخیص یک جهش پاتوژن، عامل و باعث بروز DBA اتوزومال غالب است. حاملین موتاسیون، 50% شانس انتقال جهش را به فرزندان خود دارند.

محدودیت‌های تست

• موارد نادر DBA می‌تواند با ترانسلوکاسیون‌های کروموزومی 2 جانبه یا متقابل مرتبط باشد که تنها می‌تواند توسط کاریوتایپ سیتوژنیک شناخته شود.
• در این تست ژن‌های دیگر به غیر از RPS19، RPL5 و RPL11 ارزیابی نخواهند شد.
• درصد بیماران مبتلا به DBA با موتاسیون در 3 ژنی که تست می‌شوند، حدود 27% برای RPS19، 10% برای RPL5 و 5% برای RPL11 می‌باشد.
• در میان جهش‌های ژن RPS19، 90% جایگزینی‌های کوچک، الحاق‌ها و حذف‌هایی هستند که می‌توانند توسط تعیین توالی شناسایی شوند، در حالی که 10%، حذف ناخالص یک یا تمامی اگزون‌ها هستند که نیازمند یک تست مجزا (اگزون-دوز) می‌باشد. تمامی موتاسیون‌ها در مطالعات اولیه ژن‌های RPL5 و RPL11، جایگزینی‌های کوچک، الحاق‌ها و یا حذف‌هایی هستند که توسط آنالیز تعیین توالی قابل شناسایی می‌باشند.

مواد و روش‌ها

• آنالیز توسط تعیین توالی دوجهته نواحی رمز کننده و نواحی اسپلایسینگ 6 اگزون از ژن RPS19، 8 اگزون ژن RPL5 و 6 اگزون ژن RPL11 انجام می‌گیرد.

رفرانس‌ها:

1. Vlachos A, et al. Diagnosing and treating Diamond Blackfan anaemia: results of an international clinical consensus conference. Br. J. Haemat. 2008:142(6):859–876.
2. Quarello P, et al. Multiplex ligation-dependent probe amplification enhances molecular diagnosis of Diamond-Blackfan anemia due to RSP19 deficiency. Haematologica. 2008;93:1748–1750.
3. Gazda H. Ribosomal Protein L5 and L11 Mutations are associated with cleft palate and abnormal thumbs in Diamond Blackfan anemia patients. Am J Hum Gen. 2008:83:769–780.
4. Cmejla R. Identification of mutations in the ribosomal protein L5 and ribosomal protein L11 genes in Czech patients with Diamond-Blackfan anemia. Hum Mutat. 2009;(3)321–327.

موتاسیون‌های HbS، HbC، و HbE بتاگلوبین (HBB)

برای شناسایی آلل‌های رایج بتاگلوبین: HBS، HBC و HBE

پیشینه بیماری

• هموگلوبین مولکول تترامری است که به صورت برگشت پذیری به اکسیژن در سلول‌های قرمز خون متصل می‌شود. هموگلوبین اصلی بزرگسالان (HbA)، از دو زنجیره بتاگلوبین و 2 زنجیره آلفاگلوبین تشکیل شده است.
• نقایص در شکل‌گیری کمپلکس هموگلوبین می‌تواند به هموگلوبینوپاتی (ساختار غیر طبیعی هموگلوبین) و آلفا و بتا تالاسمی (عدم تعادل در مقدار زنجیره‌های آلفا و بتا) منجر گردد.
• کم‌خونی سلول داسی شکل، رایج‌ترین هموگلوبینوپاتی مهم، به وسیله همولیز و  انسداد عروق که اندام‌های متعددی را درگیر می‌سازد، مشخص می‌شود. درد و تورم دست‌ و پا معمولاً اولین شاخص این بیماری بوده و عفونت از عوارض شایع آن می‌باشد.
• اشکال خفیف‌تر هموگلوبینوپاتی می‌تواند منجر به آنمی یا کم‌خونی همولیتیک خفیف یا متوسط گردد.

مطالعه شیوع بیماری

• هموگلوبینوپاتی‌ها شایع‌ترین بیماری‌های تک ژنی هستند با تقریباً 7% از جمعیت جهان که جهش هموگلوبین را حمل می‌کنند.
• HbS در میان مردم جنوب صحرای آفریقا، هندوستان، و خاورمیانه، شایع‌تر است؛ 10% از آفریقایی-آمریکایی تبارها، یک آلل HbS را حمل می‌کنند. شایع‌ترین شکل بیماری داسی شکل، هموزیگوسیتی HbS است.
• بیماری داسی شکل، 1 نفر را در میان هر 250 تا 600 هزار آمریکایی- آفریقایی درگیر می‌سازد. HbS عامل 70-60% از بیماری‌های داسی شکل در ایالات متحده آمریکا می‌باشد (1 نفر از 2000 نفر).
• HbC و HbE عموماً به ترتیب در افراد آفریقای غربی و نژادهای جنوب شرق آسیا رخ می‌دهد.

ژنتیک

• بتا-گلوبینوپاتی‌ها و بتا-تالاسمی‌ها، به دلیل جهش‌های ژن بتا-گلوبین (HBB ) بروز می‌کنند.
• بیش از 500 واریانت زنجیره بتا، شامل 3 جهش ســــــــــــــــــــــــــــــــــاختاری رایج: HbS (c.20A>T, p.E6V), HbC (c.19G>A, p.E6K) و HbE (c.79G>A, p.E26K)، توصیف شده است.
• هر 3 واریانت Hb، به وسیله تغییر یک اسید آمینه در زنجیره بتا-گلوبین ایجاد می‌شوند. در حالی که HbS و HbC منجر به ساختار غیرطبیعی زنجیره بتا می‌شوند، جهش HbE، اثربخشی پروسه اسپلایسینگ (به هم پیوستن، splicing) را تحت تأثیر قرار می‌دهد که منجر به کاهش مقدار زنجیره بتا می‌گردد.
• توارث HbS، HbC، و HbE، اتوزومال مغلوب است.

موارد درخواست تست

• تأیید واریانت غیر طبیعی Hb که با الکتروفورز هموگلوبین یا HPLC شناسایی شده است.
• تشخیص پیش از تولد زمانی که هر دو والد حامل HbS، HbC و HbE باشند.

تفسیر آزمایش

• هموزیگوت، هتروزیگوت، هتروزیگوت مرکب و ژنوتیپ‌های منفی گزارش می‌شود.
• منفی: هیچ یک از جهـــــش‌های ژن بتا-گلوبین،HbS (c.20A>T) ، HbC (c.19G>A) و HbE (c.79G>A)، شناسایی نشوند.
• هتروزیگوت: یک موتاسیون شناسایی شود. هتروزیگوسیتی برای HbS و HbC به شرایط حامل برای بیماری کم‌خونی داسی شکل، دلالت می‌کند. در حالی که هتروزیگوسیتی برای HbE می‌تواند با میکروسیتوز خفیف در ارتباط است.
• هموزیگوسیتی: در صورتی که دو نسخه از یک جهش شناسایی شود. هموزیگوسیتی HbS با کم‌خونی داسی شکل انطباق دارد. هموزیگوسیتی HbC و یا HbE می‌تواند منجر به کم‌خونی کشنده و میکروسیتوز گردد.
• هتروزیگوسیتی مرکب: در صورتی که دو جهش متفاوت شناسایی شود. هتروزیگوت‌های ترکیبی HbS/C می‌تواند کم‌خونی کشنده شدید و بیماری شبه داسی شکل را بروز دهد. هتروزیگوسیتی مرکب HbC/E یا HbS/E معمولاً از نظر بالینی خوش‌خیم بوده اما منجر به کم‌خونی می‌گردد.

 محدودیت‌های تست

• تنها 3 واریانت جهش رایج در ژن بتا-گلوبین شناسایی می‌گردد.
• دیگر واریانت‌های بتا و آلفا گلوبین، شناسایی نمی‌شوند.

مواد و روش‌ها

• PCR و انتقال انرژی رزونانس فلئورسانس برای شناسایی HbS (c.20A>T)، HbC (c.19G>A) و HbE (c.79G>A) به کار می‌رود.
• پروب-پوشاننده- جایگاه چندگانه (multiplex loci-spanning-probe) به طور همزمان، 3 جایگاه را بررسی می‌کند.
• حساسیت بالینی برای بیماری داسی شکل، بیش از 70% است. برای دیگر هموگلوبینوپاتی‌ها، بر اساس قومیت بیمار متفاوت است.
• حساسیت و اختصاصیت تحلیلی، بیش از 99% است.

 آزمایشات مرتبط

• تعیین توالی بتا گلوبین (HBB)
• موتاسیون فامیلی بتا گلوبین، تعیین توالی هدفمند
• موتاسیون فامیلی بتا گلوبین، تعیین توالی هدفمند، جنینی

رفرانس‌ها:

1. Buchanan GR, et al. Sickle cell disease. Hematology Am Soc Hematol Educ Program 2004;35–47.
2. Clark BE, Thein SL. Molecular diagnosis of hemoglobin disorders. Clin Lab Haematol 2004;26:159–76.
3. Giardine B, et al. HbVar database of human hemoglobin variants and thalassemia mutations: 2007 Update. Hum Mutat 2007:2(28)206–15.
4. Pont-Kingdon G, et al. Multiplex genotyping by melting analysis of loci-spanning probes: Beta-globin as an example. BioTechniques 2007;42:193–7.

برای دانلود فایل pdf  بر روی لینک زیر کلیک کنید