مروری تازه بر باسیل های گرم مثبت اسپوردار
دكتر رضا ميرنژاد (استاد دانشگاه)
باسیل‌های گرم مثبت اسپوردار عبارتند از گونه‌های كلستریدیوم و باسیلوس. این باسیل‌ها در همه‌جا پراكنده بوده و ازآنجایی‌که اسپور تولید می‌کنند، می‌توانند سال‌ها در محیط زنده بمانند. گونه‌های باسیلوس هوازی هستند درحالی‌که كلستریدیوم‌ها بیهوازی اجباری هستند
باسیلوس‌ها:
در این جنس تعداد زیادی باسیل‌های درشت، گرم مثبت، هوازی یا بیهوازی اختیاری، کاتالاز مثبت و متحرک قرار دارند که در طبیعت به فراوانی یافت می‌شوند. باسیلوس‌ها اهمیت زیادی از لحاظ پزشکی و اقتصادی دارند (بسياري از گونه‌ها استفاده صنعتي دارند و براي توليد آنتی‌بیوتیک (پلی‌میکسین B و باسيتراسين) الكل، ويتامين‌ها، حلال‌ها و آنزيم‌ها استفاده مي‌شوند).
باسيلوس آنتراسيس (Bacillus anthracis)
باسيلوس آنتراسيس باسيل گرم مثبت با 1 ميكرومتر قطر و 4 تا 10 ميكرومتر طول است كه انتهاي باسيل‌ها چهارگوش بوده و به‌صورت واگن‌هاي قطار، پشت سر هم قرار مي‌گيرند و بدون حركت است (شکل 1). كپسول آن برخلاف ساير باكتري‌ها از جنس پروتئين (D گلوتاميك) است و به همراه اگزوتوكسين در پاتوژنز باكتري نقش دارد. اسپور اين باكتري حدود يك ميكرومتر طول دارد و مي‌تواند براي مدت‌هاي طولاني در طبيعت باقي بماند. اسپور در محيط‌هاي كشت معمولي آزمايشگاه در 37 درجه سلسیوس به‌راحتی تبديل به فرم رويشي شده و به‌صورت كلافي درهم‌پیچیده درمی‌آید. اسپور باكتري در دماي 115 درجه سلسیوس در مدت 15 دقيقه غيرفعال مي‌شود، ولي قادر است سال‌ها (حتي تا 20 سال) در خاك و فرآورده‌هاي دامي زنده بماند كه اين ويژگي عامل مهمي در انتشار بيماري به‌حساب مي‌آيد.
در ميان عوامل زيستي كه به‌عنوان سلاح بيولوژيك به‌كار مي‌روند، اين باكتري جايگاه ويژه‌اي دارد. سیاه‌زخم يكي از جدي‌ترين بيماري‌هايي است كه مي‌تواند تعداد زيادي كشته در يك شهر يا منطقه بر جاي بگذارد. اسپور سیاه‌زخم داراي مشخصاتي است كه آن را براي يك سلاح بيولوژيک مناسب مي‌سازد. دوز كشنده تنفسي اسپور حدود يك بيليونيم گرم است. از سوي ديگر، دانشمندان با دستكاري در ژن اين ميكروب قادرند گونه‌هاي مقاوم در برابر واكسن‌ها و درمان‌هاي موجود را توليد نمايند.
شکل (1): نماي باسيل‌هاي چهارگوش پشت سرهم باسيلوس آنتراسيس
این باکتری در خون، گوشت، پشم، پوست، مو، ادرار و مدفوع حیوانان مبتلا به سیاه‌زخم یافت می‌شود و باعث آلودگی چراگاه‌ها و مزارع می‌گردد و انسان به‌صورت تصادفی از طریق خراش پوستی، تماس با حیوانات آلوده، تنفس و مواد خوراکی آلوده می‌گردند. باسيلوس آنتراسيس موجب بيماري سیاه‌زخم (آنتراكس) مي‌شود. اين نام از كلمه يوناني anthrakis به معني زغال گرفته شده كه به خاطر رنگ سياهي است كه در زخم ناشی از بيماري ايجاد مي‌شد. اين بيماري عمدتاً بيماري گوسفند، بز، گوساله، اسب و چارپايان است و حيوانات ديگر (مانند موش صحرايي) به اين بيماري نسبتاً مقاوم هستند.
در انسان تقريباً 95 درصد از موارد سیاه‌زخم را فرم پوستي (پوستول بدخيم) و 5 درصد موارد را عفونت تنفسي (بيماري پشم‌ريسان (Woolsorters’ disease) تشکيل مي‌دهد. سیاه‌زخم گوارشي نادر است و در بيشتر موارد از آفريقا و آسيا كه گوشت آلوده را مصرف مي‌كنند، گزارش شده است. در حيوانات، سیاه‌زخم گوارشي بيشتر از دو فرم ديگر بيماري است. آنتراكس مغزي (Meningeal anthrax) در حدود 5 درصد موارد، از ادامه سه فرم ديگر آنتراكس حاصل مي‌شود. باكتري توسط خون به مغز رفته و سبب مننژيت هموراژيك مي‌گردد.
اقدامات لازم برای پیشگیری از بیماری در مناطق اندمیك عبارتند از:
سوزاندن یا دفن لاشه‌های آلوده در گودال‌های عمیق دارای آهك، ضدعفونی محصولات حیوانی (با اتوكلاو)، استفاده از دستكش و پوشاك محافظت‌كننده در افرادی كه در خطر بالای ابتلا قرار دارند، ایمن‌سازی فعال دام‌ها به كمك واكسن زنده ضعیف شده و واكسینه كردن افرادی كه در خطر شغلی بالایی هستند.
این واكسن، از نوع بدون سلولی و حاوی آنتی‌ژن محافظت‌كننده خالص‌شده است.
باسيلوس سرئوس
باسيلوس سرئوس به‌صورت ساپروفيت در خاك، آب و هوا بسر مي‌برد. اين باكتري برخلاف باسيلوس آنتراسيس متحرك بوده و هموليزين توليد مي‌كند. اين باكتري در انسان سبب مسموميت غذايي مي‌شود كه دو شكل مجزا دارد: نوع استفراغ‌دهنده كه ناشي از مصرف برنج پخته‌شده است و نوع اسهالي كه ناشي از مصرف گوشت و سس است. باسيلوس سرئوس در غذا يا روده دو انتروتوكسين توليد مي‌كند. شيوه عمل يكي از انتروتوكسين‌هاي آن مشابه سم وبا است و ايجاد اسهال مي‌كند. شيوه عمل انتروتوكسين ديگر شبيه به انتروتوكسين استافيلوكك اورئوس است كه فرم استفراغي را سبب مي‌شود.
اين فرم از انتروتوكسين مقاوم به گرما است. فرم اسهالي مسموميت غذايي ناشي از باسيلوس سرئوس 18-10 ساعت پس از خوردن برنج پخته و محصولات لبني در فرد ايجاد مي‌شود و مشابه مسموميت غذايي ناشي از كلستريديوم پرفرنژنز است.
فرم استفراغي مسموميت غذايي ناشي از باسيلوس سرئوس 5-1 ساعت پس از خوردن غذاهاي آلوده به سم يا اسپور در فرد ظاهر شده و علاوه بر استفراغ، تهوع نيز مشاهده مي‌شود. براي اين بيماري درمان آنتي‌بيوتيكي توصيه نشده و فقط درمان علامتي صورت مي‌گيرد. براي پيشگيري روش خاصي وجود ندارد.
باسیلوس سرئوس علاوه بر مسمومیت غذایی عامل مهم عفونت‌های چشمی شامل كراتیت شدید، اندوفتالمیت و پان‌افتالمیت است. به‌طور تیپیك ارگانیسم توسط جسم خارجی ناشی از ضربه وارد چشم می‌شود. این باکتری با عفونت‌های موضعی مثل اندوكاردیت، مننژیت، استئومیلیت و پنومونی ارتباط دارد. مصرف داروهای تزریقی یا وجود وسایل پزشكی در بدن، احتمال بروز این عفونت‌ها را بالا می‌برد.
باسيلوس سوبتيليس عامل مسموميت غذايي است و گاهی سبب عفونت در افراد با ضعف ايمني مي‌شود.
تشخيص آزمايشگاهي:
نمونه‌های ارسالی به آزمایشگاه: براي تشخیص بيماري سیاه‌زخم، از خون، CSF، چرك آبسه (پوستول)، خلط و مدفوع بيمار نمونه‌برداري مي‌نمايند و براي تشخیص مسموميت غذايي از باقيمانده مواد غذايي، مدفوع بيمار، مواد حاصل از استفراغ يا نمونه‌هاي ديگر (نمونه‌هاي چرك و خلط) استفاده می‌شود. در زخم‌های تازه می‌توان مایع را با خراشیدن ضایعه به‌وسیله سوزن تهیه و توسط سوآب برداشت نمود.
برای تشخیص باسیلوس‌ها از روش‌های زیر استفاده می‌شود:
آزمایش مستقیم
از نمونه‌ها دو لام تهیه کرده و بعد از خشک کردن، یک لام را رنگ‌آمیزی گرم و دیگری را که به‌طور ناقص با سه بار عبور سریع از روی شعله فیکس شده است، با رنگ گیمسا رنگ نمایید.
باسیل شاربن (سیاه‌زخم) در رنگ‌آمیزی گرم به‌صورت باسیل‌های بزرگ گرم مثبت، کپسول‌دار و بدون اسپور و مشابه واگن‌های قطار پشت سرهم قرار می‌گیرند. در رنگ‌آمیزی گیمسا به شکل باسیل‌های آبی که به‌وسیله مواد کپسولی (قرمز– ارغوانی) به‌طور نامنظم احاطه شده است، مشاهده می‌گردد (شکل 2).
شکل (2): باسیلوس آنتراسیس در گسترش خون (چپ) رنگ‌آمیزی گرم (راست)
کشت
نمونه‌ها را می‌توان مستقيماً در محيط‌هاي آزمايشگاهي در شرايط خاص (با رعايت شرايط ايمني براي سیاه‌زخم) كشت داد. براي نمونه‌هاي مدفوع در مسموميت غذايي مي‌توان از شوك حرارتي استفاده نمود، به اين صورت كه نمونه را در سرم فيزيولوژي يا آب مقطر رقيق نموده و در حرارت 62/5 درجه براي 15 دقيقه (70 درجه به مدت 10 دقيقه) قرار مي‌دهند تا كليه باكتري‌هاي فعال از بين رفته و فقط اسپورهاي باقيمانده را بر روي محيط‌هاي مختلف كشت مي‌دهند. پس از انكوباسيون در 37-35 درجه براي مدت 24-18 ساعت، مشخصات كلني را بررسي مي‌نمايند.
باسيلوس‌ها، از جمله باسيل سیاه‌زخم و سرئوس كلني‌هاي بزرگ، پهن، نامنظم با حاشيه چين‌دار به‌اندازه mm4-5 که در اطراف كلني رشته‌هايي (فيلامان) كشيده و پيچيده شبيـــــه مـــوي مجعد (Medusa head) ایجاد می‌نمایند. كشت نمونه باكتري در مجاورت –Co2 ,HCO3 و محيط‌های غني، سبب ايجاد كپسول پلي‌پپتيدي (از جنس پلي‌گاما دي‌گلوتاميك اسيد) مي‌گردد.
تست سرولوژی
امروزه، آزمایش‌هایی برای اندازه‌گیری آنتی‌بادی‌های تولیدشده بر ضد توکسین‌های ادم‌دهنده و کشنده در دسترس است، اما کاربرد چندانی ندارد. در استفاده از این تست‌ها می‌بایست افزایش 4 برابر آنتی‌بادی در عرض 4 هفته بررسی شود. یک تست مثبت باید یا دارای افزایش 4 برابر در تیتر و یا به تنهائی دارای تیتر بالاتر از 1:32 باشد.
افتراق باسيلوس آنتراسيس از سایر باسیلوس‌ها:
باسيلوس آنتراسيس بر روي محيط بلاد آگار فاقد هموليز بوده درحالی‌که باسيلوس سرئوس و بقيه باسيلوس‌ها هموليز β ايجاد مي‌نمايند. باسيلوس آنتراسيس در كمتر از 14 درجه و بيشتر از 44 درجه رشد نـــمي‌كند و در 44-42 قدرت بيماري‌زايي خود را از دست مي‌دهد. چنانچه این باکتری را در محيط لوله حاوي ژلاتين كشت دهند، حالتي شبيه سرو وارونه (قيف) ايجاد مي‌كند و در محيط آب پپتونه و آبگوشت، دانه درشت در ته لوله و پرده نازك در سطح تشکیل می‌دهد، درحالی‌که بقيه باسيلوس‌ها لوله را كدر مي‌كنند. باسيل سیاه‌زخم قندها را بدون ايجاد گاز تخمير، نشاسته را هيدروليز، سرم را منعقد و شير تورنسل‌دار را منعقد و بي‌رنگ مي‌كند.
كاتالاز، اكسيداز و VP مثبت بوده و نيترات را به نيتريت تبدیل می‌نماید. باسيلوس آنتراسيس بر روي محيط ائوزین متیلن بلو دارای رشد ضعيف يا فاقد رشد است. تزريق نمونه مشكوك به سیاه‌زخم، به حيوان حساس (خوكچه هندي) سبب مرگ آن حیوان پس از 48-24 ساعت مي‌گردد. باسیل سیاه‌زخم به فاژ گاما (γ) حساس بوده، درحالی‌که سایر باسيلوس‌ها مقاوم هستند. باسيلوس سرئوس مانند باسيلوس آنتراسیس لسيتيناز مثبت است. در جدول 1 وجه تمایز باسيلوس آنتراسیس و باسيلوس سرئوس نشان داده شده است.
جدول (1): وجه تمایز باسيلوس آنتراسیس و باسيلوس سرئوس
| مشخصات | باسيلوس آنتراسیس | باسيلوس سرئوس |
| هموليز بتا روي محيط بلاد آگار | متغير | بتا |
| رشد در شرایط بیهوازی | + | + |
| حرکت | – | + |
| لسیتیناز | + | + |
| هیدرولیز نشاسته | + | + |
| سالیسین | – | + |
| تولید بتالاکتاماز | – | + |
تست رشته مرواريد (گردن‌بند) (String test):
چنانچه باسيل سیاه‌زخم به‌صورت غلیظ بر روي محيط مولرهينتون کشت داده شده و یک ديسك 10 واحدي پني‌سيلين روي آن به مدت 6-3 ساعت انكوبه شود، پس از برداشت نمونه از حاشیه ناحیه عدم رشد و تهيه گسترش و رنگ‌آميزي مي‌توان باكتري‌ها را به‌صورت رشته مرواريد (گردن‌بند) مشاهده نمود، درحالی‌که بقيه باسيلوس‌ها اين خصوصيت را ندارند. تشکیل رشته مروارید بدلیل حساسیت باسيل سیاه‌زخم به پنی‌سیلین است.
تست آسكولي
تست آسکولی آزمایشی حساس براي بررسي علت مرگ حيوان ناشي از باسيل سیاه‌زخم است؛ به اين صورت كه قطعه كوچكي از احشاء حيوان مرده در اثر بیماری سیاه‌زخم را در هاون كوبيده، سپس به آن 5 برابر سرم فيزيولوژي اضافه نموده و آن را مي‌جوشانند، پس از سرد شدن، مقدار ml 0/5 از آن را در يك لوله آزمایش ريخته و بر روي آن چند قطره آنتی‌بادی اختصاصي مي‌ريزند. چنانچه صفحه كدري در محل برخورد آنتی‌ژن با آنتی‌بادی مشاهده شود (واكنش پرسي‌پيتاسيون) دليل بر وجود آنتی‌ژن باسيل سیاه‌زخم است.
نکته 1:
آنتراكس را نمی‌توان در گستره‌های خشك با تكنیك‌های رنگ‌آمیزی ایمونوفلورسانس شناسایی نمود. در آزمایشگاه‌های کلینیکی و مرجع از كشت دادن، تلقیح به حیوانات آزمایشگاهی (موش و خوكچه هندی)، فاژتایپینگ، الیزا و روش‌های مولکولی (PCR) در تشخیص آزمایشگاهی باسیلوس آنتراسیس استفاده می‌شود.
نکته 2:
باسيلوس سرئوس را مي‌توان در افراد دچار سوختگي، زخم پس از عمل جراحي، مننژيت، آبسه‌هاي مغزي، خلط و خون بدست آورد. وجود 105 عدد باكتري و اسپور در يك گرم غذا يا مدفوع دليل بر آلودگي است.
نکته 3:
چنانچه باسيلوس‌ها در كشت كهنه گرم منفي نشان داده شود، براي تمايز اينها از باسيل‌هاي گرم منفي واقعي از بررسی حساسيت به دیسک وانكومايسين استفاده مي‌شود كه باسيلوس‌ها حساس ولي باسيل‌هاي گرم منفي‌ها مقاوم‌اند. همچنین اگر كلني باسيل‌هاي گرم منفي را در يك قطره سود 40% حـل نماییم، ايجاد ويسكوزيته نموده و تشكيل رشته مي‌دهند، درحالی‌که باسيلوس‌ها ايجاد ويسكوزيته نمي‌نمايند.
رنگ‌آميزي اسپور:
1- از نمونه گسترش تهيه کرده و لام را فيكس نمایید.
2- سپس رنگ مالاشيت گرین را روی لام ریخته و 7-5 دقيقه حرارت دهید.
3- رنگ را خالی و لام را با آب شستشو داده و رنگ سافرانين را به مدت یک دقیقه روی آن بریزید.
4- درنهایت رنگ را خالی و لام را با آب شستشو دهید. پس از خشك نمودن، لام را زیر میکروسکوپ مشاهده نمایید. در لام اسپورها به رنگ سبز و جسم باكتري به رنگ صورتي يا قرمز ديده مي‌شود. از رنگ‌آميزي مولر هم براي مشاهده اسپور استفاده مي‌نمايند.
كلستريديومها
باسيل‌هاي گرم مثبت (بجز کلستریدیوم راموسم و کلستریدیوم کلستریدیوفورم که معمولاً گرم منفی هستند)، بي‌هوازي مطلق يا ميكروآئروفيل و اسپوردار هستند كه قطر اسپور از عرض باسيل بيشتر بوده و سبب برجستگي در انتها يا نزديك به انتها و مركز باسيل مي‌گردد. براي تبديل اسپور به فرم فعال نياز به شرايط بي‌هوازي است. اكثر كلستريديومها متحرك‌اند (به‌جز كلستريديوم پرفرنژنز و كلستريديوم بوتيريكوم که غیرمتحرک هستند)، فاقد آنزيم كاتالاز و پراكسيداز مي‌باشند و قندهاي گوناگوني را تخمير مي‌كنند.
بسياري از آنها پروتئين را تجزيه، شير را اسيدي كرده و بعضي شير را هضـــــم و تخمير طوفاني (stormy fermentation ) (لخته‌لخته كردن شير) به‌وجود مي‌آورند (جدول 2).
جدول (2): برخی ویژگی‌های مفید برای شناسایی گونه‌های مختلف کلستریدیوم
كلستريديوم بوتولينم (Clostridium botulinum)
باسيل درشت به‌اندازه 8-4 ميكرون و اسپور آن نزديك به انتها است. اين باكتري سبب مسموميت غذايي (بوتوليسم) مي‌شود و براي تشخيص آن از نمونه‌هاي مدفوع، مواد غذايي و استفراغ به‌صورت زیر استفاده مي‌شود:
در ابتدا نمونه‌هاي برداشت‌شده را در سرم فيزيولوژي حل نموده و با انجام شوك حرارتـــــي (80 درجه براي 30 دقيقه) اشكال فعال باكتري‌ها را از بين برده که در این صورت فقط اسپورها زنده مانده و با كشت آنها در شرايط بي‌هوازي بر روی محيط‌هاي بلاد آگار و محیط نوترینت آگار آنها را مورد بررسی قرار می‌دهند.
جستجوي سم در مواد غذايي
مقداري از مواد غذايي را در سرم فيزيولوژي حل نموده و به آن 100 واحد پني‌سيلين در هر ميلي‌ليتر افزوده و سپس به داخل صفاق موش تزريق مي‌نمایند. از آنجائي كه كلستريديوم بوتولينم انواع سموم (F,E,B,A) را تولید نموده که بيشترين مسموميت غذايي را ايجاد مي‌كنند، از اين رو در ابتدا به هر يك از موش‌ها آنتی‌بادی علیه انواع سموم ذکرشده (به هر موش یک نوع آنتی‌بادی) را تزريق نموده و سپس هر يك از موش‌ها را با موش شاهد كه در اثر سم مي‌ميرند، مقايسه می‌نمایند.
زنده ماندن موش نشان‌دهنده وجود نوع سم است كه با آنتی‌بادی که قبلاً تزریق شده بود، خنثي شده است. در آزمایشگاه با انجام تست‌هاي سرولوژيكی (هماگلوتيناسيون غيرفعال يا راديوايمنواسي)، سم را مي‌توان شناسايي نمود. امروزه از روش‌هاي تشخيص سريع مولكولي مانند PCR در تشخيص بيماري استفاده مي‌شود. لازم به ذکر است که در بوتولیسم نوزادی، باکتری و توکسین آن را می‌توان در محتویات روده نه در سرم شناسایی کرد.
نکته:
از تست فعالیت لیپاز روی محیط Egg-Yolk agar برای شناسایی كلستريديوم بوتولينم استفاده می‌شود. لازم به ذکر است که تعداد کمی از كلستريديومها مانند كلستريديوم بوتولينم، كلستريديوم نوه‌ای و كلستريديوم اسپورژنز دارای فعالیت لیپاز هستند (شکل 3).
شکل (3): تست فعالیت لیپاز كلستريديوم بوتولينم روی محیط Egg-Yolk agar
كلستريديوم تتاني (Clostridium tetani)
كلستريديوم تتاني همانند كلستريديوم بوتولينم يك ارگانيسم مهاجم نيست. عفونت به‌طور كاملاً موضعي به بافت مرده‌اي كه اسپورها در آن وارد شده‌اند (زخم، سوختگي، جراحت، محل بريدگي بندناف و بخيه جراحي)، محدود است. ميزان عفونت بافتي كم بوده و بيماري تقريباً به‌طور كامل، يك توكسیمي است. جوانه زدن اسپور و ايجاد ارگانيسم‌هاي رويشي كه سم توليد مي‌كنند توسط بافت نكروزه، نمك‌هاي كلسيمي و عفونت‌هاي چرك‌زاي همراه كه همگي سبب ايجاد محيطي با پتانسيل اكسيداسيون احياء پايين مي‌گردند، تسهيل مي‌شود.
سمي كه از سلول‌هاي رويشي آزاد مي‌شود، به دستگاه اعصاب مركزي رفته و به‌سرعت به گیرنده‌هایی در طناب نخاعي و ساقه مغز متصل و سبب ايجاد اثرات فوق مي‌گردد.
تشخيص آزمايشگاهي
تشخيص بيماري بر اساس تصوير باليني و تاريخچه جراحت است، اگرچه 50 درصد بيماران جراحتي دارند كه به اقدامات پزشكي نياز است. كشت‌هاي بي‌هوازي از بافت زخم آلوده ممكن است حاوي كلستريديوم تتاني باشند، ولي مصرف پيشگيري‌كننده و درماني آنتي‌توكسين، هیچ‌کدام نبايد مانع انجام اين آزمون شود. اثبات جداسازي كلستريديوم تتاني بايد بر اساس توليد سم و خنثي‌سازي آن با آنتي‌توكسين اختصاصي صورت گيرد. باید توجه داشت که مسموميت با استريكنين (Strychnine poisoning) علائمي شبيه به کزاز مي‌دهد.
كلستريديوم تتاني به شکل باسيل گرم مثبت داراي اسپور انتهايي و گرد با قطر بيشتر از قطر باسيل و شبيه چوب طبل يا چوب كبريت است، متحرك و بدون كپسول است و در شرايط بي‌هوازي مطلق بر روي محيط بلاد آگار در 37 درجه رشد نموده و داراي هموليز β و حركت سوارمينگ است. از نظر بيوشيميايي غیرفعال بوده و دارای فعاليت پروتئوليتيك ضعيف و اساكاروليتيك (غیر تخمیرکننده) است، همچنین این باکتری ژلاتين را به‌کندی ذوب مي‌كند.
پس از رنگ‌آميزي نمونه و مشاهده باسيل شبيه چوب طبل، در شرايط بي‌هوازي كشت داده شده و بعد از آن، از کلنی‌های به‌دست‌آمده به حيوان حساس تلقيح می‌گردد و نتایج مورد بررسی قرار می‌گیرد.
کلستريديوم پرفرنژنز (Clostridium perfringenes)
بسياري از كلستريديوم‌هاي مولد سم در صورت ورود به بافت آسيب‌ديده، مي‌توانند عفونت‌هاي مهاجم (مثل گانگرن گازي و نكروز عضله) ايجاد كنند. در حدود 30 گونه از كلستريديومها ممكن است چنين اثري را ايجاد نمايند ولي شايع‌ترين آنها كلستريديوم پرفرنژنز (90 درصد) است. انتروتوكسين ناشي از كلستريديوم پرفرنژنز يك عامل شايع مسموميت غذايي است.
كلستريديوم پرفرنژنز كه قبلاً به آن كلستريديوم ولشاي مي‌گفتند، در مدفوع انسان و حيوانات به مقدار زياد وجود دارد و از آنجا وارد شير و خاك مي‌گردد. اين باکتري در دستگاه گوارش و ادراري تناسلي انسان يافت مي‌شود و برخلاف ساير كلستريديومها بدون حركت بوده و قطر اسپور بيضي شكل آن (که در مركز يا نزديك به انتها واقع شده است) از قطر خود باسيل كمتر است و باعث برجستگي در باسيل نمي‌شود. اين باكتري در بدن حيوان و محيط‌هايي كه حاوي سرم باشند، ايجاد کپسول مي‌كند.
باکتری در زخم آلوده به دنبال شكستگي مركب، زخم پس از زايمان و غيره با ایجاد بيماري بعد از يک دوره کمون 1 تا 3 روزه با علائم كريپتاسيون، ترشح بدبو، نكروز پيش‌رونده در عضلات و بافت زيرجلدي، تب، هموليز، توكسمي و شوك تظاهر مي‌يابد و در نهايت منجر به مرگ مي‌شود. همچنين اين باكتري سبب انتريت نكروزان شده كه در كودكان بسيار كشنده است.
مسموميت غذايي ناشي از كلستريديوم پرفرنژنز، معمولاً به دنبال مصرف تعداد زيادي از كلستريديوم‌هايي كه در ظروف حاوي گوشت رشد كرده‌اند، ايجاد مي‌شود. سم وقتي توليد مي‌شود كه ارگانيسم در دستگاه گوارش اسپور توليد مي‌كند و معمولاً پس از 18-6 ساعت اسهال (معمولاً بدون تب و استفراغ) را سبب مي‌شود که فقط 1 تا 2 روز به طول مي‌انجامد.
تشخيص آزمايشگاهي
در گستره‌هاي بافتي و نمونه‌هاي به‌دست‌آمده از زخم و چرك، باسيل‌هاي گرم مثبت بزرگ مشاهده مي‌شوند، درحالی‌که اسپورها ديده نمي‌شوند، زيرا آنها عمدتاً در شرايط كمبود مواد غذايي به‌وجود مي‌آيند. ارگانيسم‌ها در محیط گوشت‌دار حاوی گلوکز (chopped-meat)، محیط تیوگلیکولات و در محیط بلاد آگار كشت داده شده و در شرایط بیهوازی در 37-35 درجه انکوبه می‌گردند. کلنی كلستريديوم پرفرنژنز روی این محیط‌ها بعد از انکوباسیون 48 ساعته، 3-1 میلی‌متر قطر، صاف، برآمده با حاشیه ریزوئیدی است که بعد از انکوباسیون طولانی مدت قطر آن به 15-4 میلی‌متر می‌رسد.
كلستريديوم پرفرنژنز از طريق واكنش‌هاي تخمير قندها و توليد اسيدهاي آلي شناسايي مي‌شوند و در محيط كشت حاوي شير، تخمير طوفاني همراه با تولید گاز در مدت 24 ساعت ايجاد مي‌كند كه نشان‌دهنده قدرت تجزيه پروتئوليتيك اين باكتري است. باكتري روي محيط آگار خون‌دار ايجاد هموليز دوبل مي‌كنــد كه مشخصـــه كلســـــتريديوم ولشاي است (شکل 4). از آگار حاوی زرده تخم‌مرغ Egg yolk agar (EYA) براي نشان دادن اثر سم لسیتيناز استفاده مي‌شود، بدین صورت که در اطراف کلنی‌های با تست مثبت، هاله‌ای از رسوب دیده می‌شود. تأیید نهايي بر اساس توليد سم و خنثي شدن آن توسط آنتي‌توكسين‌هاي اختصاصي مربوطه (واكنش ناگلر) انجام مي‌گيرد. برای کسب اطلاعات بیشتر به مقاله چاپ‌شده در این زمینه در شماره 69 (اردیبهشت ماه 1388) ماهنامه اخبار آزمایشگاهی مراجعه نمایید.
شکل (4): تشکیل همولیز دوبل توسط كلستريديوم پرفرنژنز
كلستريديوم ديفيسيل (Clostridium difficile)
اين ارگانيسم در دستگاه گوارش حدود 3 درصد جمعيت عادي و تا 30 درصد بيماران بستري در بيمارستان وجود دارد. كلستريديوم ديفيسيل شايع‌ترين علت اسهال‌هاي بيمارستاني است (اسهال ناشي از اين باكتري، برخلاف اسهال ناشي از ارگانيسم‌هاي ديگر، معمولاً بيش از 72 ساعت پس از بستري در بيمارستان آغاز مي‌شود). انتقال اين ارگانيسم از طريق دهاني –مدفوعي صورت مي‌گيرد. دستان پرسنل بيمارستاني نقش مهمي را به‌عنوان واسطه انتقال باكتري ايفا مي‌كنند.
آنتيبيوتيكها (از قبيل سفالوسپورين‌هاي وسيع‌الطيف، آمپي‌سيلين و كليندامايسين)، ارگانيسم‌هاي حساس به داروي موجود در فلور طبيعي بدن را از بين مي‌برند؛ در نتيجه اين امر، كلستريديوم ديفيسيل به‌طور مرتب رشد و تكثير پيدا مي‌كند. دو اگزوتوكسين A و B توسط اين باكتري توليد مي‌شوند. اگزوتوكسين A انتروتوكسيني است كه فعاليت سيتوتوكسيک قوي دارد و به حاشيه مسواكي سلول‌هاي پوششي روده در محل گيرنده‌ها مي‌چسبد.
سم B يك سيتوتوكسين قوي است كه موجب صدمه به مخاط كولون و تشكيل غشاي كاذب مي‌شود. كليندامايسين اولين آنتي‌بيوتيكي بود كه نقش آن در ايجاد كوليت سودوممبرانو (كوليت با غشاي كاذب) مشخص گرديد. امروزه آنتي‌بيوتيك‌هاي بسياري شناخته شده‌اند كه موجب اين بيماري مي‌شوند. در حال حاضر، سفالوسپورين‌هاي نسل دوم و سوم به علت استفاده گسترده از آنها شايع‌ترين علت بروز اين بيماري هستند. علاوه بر آنتيبيوتيكها، داروهاي شیمی‌درمانی سرطان نيز استعداد ابتلا به كوليت با غشاي كاذب را افزايش مي‌دهند. كلستريديوم ديفيسيل به‌ندرت به مخاط روده حمله مي‌كند.
تشخيص آزمايشگاهي
تشخیص التهاب روده بزرگ با غشای کاذب (Pseudomembranous colitis) با شناسایی یک یا دو اگزوتوكسين از توکسین‌های کلستریدیوم دیفسیل در مدفوع، بیوپسی، کولونوسکوپی و مشاهده غشاهای کاذب و یا آبسه‌های کوچک در بیمارانی که آنتی‌بیوتیک‌ها را دریافت نموده‌اند و مبتلا به اسهال شده‌اند صورت می‌گیرد. ممکن است اسهال خونی یا آبکی بوده و بیمار دچار دردهای شکمی، افرایش گلبول سفید و تب باشد. اگزوتوکسین B یک سیتوتوکسین قدرتمند بوده که آن را مي‌توان از طريق تأثير مخرب آن بر كشت‌هاي سلولي در نمونه مدفوع شناسايي كرد.
همچنين اگزوتوکسین A یک انتروتوکسین قوی است که تا حدودی فعالیت سیتوتوکسیک دارد و با به‌کارگیری آنتي‌بادي‌هاي اختصاصي مهاركننده تخريب سلولي، وجود اگزوتوكسين در نمونه مدفوع تأييد مي‌شود. كشت در شرایط بي‌هوازي برای این باکتری معمولاً صورت نمي‌گيرد. برای ردیابی توکسین در مدفوع از تکنیک‌های لاتکس آگلوتیناسیون و آنزیم ایمنواسی (EIA) استفاده می‌گردد.
نکته:
1- نمونه سوآب برای تشخیص کلستریدیوم دیفسیل در مدفوع مناسب نیست چرا که مقدار نمونه برداشت‌شده ناچیز است.
2- اگر تشخیص در همان روز نمونه‌گیری صورت نمی‌گیرد، بایستی نمونه‌ها را روی یخ خشک به آزمایشگاه انتقال داد و در یخچال گذاشت تا فعالیت سیتوتوکسیسیته کلستریدیوم دیفسیل کاهش نیابد. همچنین نمونه‌ها را نبایستی بیش از دو ساعت در حرارت اتاق نگهداری کرد.
3- کلستریدیوم دیفسیل با کمک تکنیک جداسازی اسپور (شوک گرمائی و شوک الکلی) شناسایی می‌شود.
4- می‌توان از محیط‌های کشت فنیل اتیل الکل (PEA) و سیکلوسرین- سفوکستین، زرده تخم‌مرغ، فروکتوز آگار (CCFA) و بلادآگار غیراختصاصی بیهوازی برای کشت کلستریدیوم دیفسیل استفاده کرد. کلستریدیوم دیفسیل روی این محیط‌ها بعد از 48 ساعت، کلنی‌های صاف، برآمده، خاکستری رنگ با حاشیه ریزوئیدی بدون همولیز و هاله کدورت (چون لیپاز و لسیتیناز منفی است) ایجاد می‌کند (شکل 5).
شکل (5): نمای کلنی کلستریدیوم دیفسیل روی محیط CCFA
برای دانلود پی دی اف بر روی لینک زیر کلیک کنید
ورود / ثبت نام