اصول فنی تجهیزات آزمایشگاهی (۳)

اصول فنی تجهیزات آزمایشگاهی قسمت سوم: روش‌های جداسازی؛ الکتروفورز، کروماتوگرافی

اصول فنی تجهیزات آزمایشگاهی

قسمت سوم

روش‌های جداسازی؛ الکتروفورز، کروماتوگرافی 

مهندس احسان درخشان نیا

derakhshannia@hotmail.com

الکتروفورز، کروماتوگرافی

کروماتوگرافی

کروماتوگرافی عبارت جامعی است برای یک مجموعه از تکنیک‌های آزمایشگاهیِ مورد استفاده در جداسازی ترکیب‌ها؛ به بیان بهتر کروماتوگرافی یک روش جداسازی توانمند است که در تمام شاخه‌های علوم کاربردهایی دارد و به‌طور گسترده برای جداسازی، شناسایی و تعیین اجزای سازنده شیمیایی در مخلوط‌های پیچیده بکار می‌رود. تا اواسط قرن نوزدهم، جداسازی‌های تجزیه‌ای عمدتاً‌ به‌وسیله روش‌های کلاسیک مانند رسوب‌گیری، تقطیر و استخراج انجام می‌شد، کمی بعد از شروع قرن بیستم، کروماتوگرافی توسط گیاه‌شناسی روسی، میخائیل تسوت-  MikhailTswett ابداع و نامگذاری شد. او این فن را برای جدا کردن رنگدانه‌های گیاهی مختلف از قبیل کلروفیل و زانتوفیل، با عبور دادن محلول‌هایی از این ترکیبات از داخل یک ستون شیشه‌ای که با گرد نرم کلسیم کربنات انباشته شده بود، بکار برد. از آنجا که گونه‌های جداشده به‌صورت نوارهای رنگی در ستون ظاهر شدند، وی نام کروماتوگرافی را برای این روش انتخاب کرد. لازم به ذکر است که در زبان یونانی کروما- chroma یعنی «رنگ» و گرافی- graphein یعنی نوشتن.

کاربرد کروماتوگرافی نه تنها به دلیل ابداع چند نوع جدیدِ فن کروماتوگرافی، بلکه به دلیل افزایش نیاز دانشمندان به روش‌های بهتر برای تشخیص اجزای مخلوط‌های پیچیده، به‌طور حیرت‌آوری گسترش یافته است. تأثیر شگفت‌آور این روش‌ها بر علم را می‌توان با اهدای جایــــــــــزه نوبل ۱۹۵۲ به مارتین و سینج-  A. J. P. Martin and R.L. M. Syngeبه پاس اکتشافات آنها در زمینه کروماتوگرافی دریافت. شاید نشانه بارزترین تأثیر، فهرستی از دوازده جایزه نوبل باشد که بین سال‌های ۱۹۳۷ و ۱۹۷۲ به پاس تلاش‌هایی اهدا گردیده است که در آنها کروماتوگرافی نقش حیاتی داشته است. هم‌اکنون این فهرست بدون شک به‌طور قابل‌توجهی افزایش یافته است.

در تمام جداسازی‌های کروماتوگرافی، نمونه، در یک فاز متحرک که ممکن است گاز، مایع یا سیال ابر بحرانی-  Supercritical Fluid باشد، حل می‌شود. سپس این فاز متحرک از درون یک فاز ساکن امتزاج‌ناپذیر که بر سطح یک جامد یا در محلی داخل ستون تثبیت شده است، با فشار عبور داده می‌شود. دو فاز طوری انتخاب می‌شوند که اجزای نمونه خود را با درجات مختلفی بین فاز ساکن و متحرک توزیع کنند. آن اجزائی که با فاز ساکن قویاً نگه داشته می‌شوند به آهستگی با جریان فاز متحرک حرکت می‌کنند. در مقابل، اجزائی که به‌طور ضعیف به‌وسیله فاز ساکن نگه داشته می‌شوند، به‌سرعت حرکت می‌کنند. در نتیجه‌ی این اختلافات در تحرک، اجزای نمونه به نوارهای مجزا جدا می‌شوند که می‌توان از آنها در تجزیه‌ی کیفی و یا کمی استفاده کرد. فاز ساکن، مایع و یا جامد و فاز متحرک، گاز و مایع می‌باشد. عاملی که بین تمام روش‌های کروماتوگرافی مشترک است، اختلاف در آهنگ حرکت مؤلفه‌های مخلوط در فاز متحرک است که در اثر واکنش بین مؤلفه‌های با فاز ساکن که برای جداسازی اجزاء بکار می‌رود، اتفاق می‌افتد.

روش‌های کروماتوگرافی را می‌توان به دو طریق دسته‌بندی کرد؛ اولین طریق بر اساس ابزار فیزیکی بنا شده است که به کمک آن فازهای متحرک و ساکن با یکدیگر تماس برقرار می‌کنند. در کروماتوگرافی ستونی، فاز ساکن در یک ستون باریک قرار دارد که از داخل آن فاز متحرک تحت تأثیر نیروی فشار عبور داده می‌شود. در کروماتوگرافی مسطح، فاز ساکن بر روی یک صفحه مسطح و یا در لابه‌لای یک صفحه کاغذ قرار داده می‌شود؛ در اینجا فاز متحرک از لابه‌لای فاز ساکن تحت اثر مویینه‌ای حرکت می‌کند.

یک دسته‌بندی اساسی‌تر روش‌های کروماتوگرافی بر پایه انواع فازهای متحرک و ساکن و انواع تعادل‌های درگیر در انتقال مواد حل شده بین فازها بنا شده است. سه گروه عمومی کروماتوگرافی مایع- LC، کروماتوگرافی گازی- GC و کروماتوگرافی سیال ابر بحرانی- SFC. همانطور که از نام آنها پیداست، فاز متحرک در سه گروه به ترتیب عبارتند از: مایعات، گازها و سیالات ابر بحرانی. به بیان دیگر، اگر فاز متحرک گاز باشد، سیستم حاصل کروماتوگرافی گازی نامیده می‌شود و اگر فاز متحرک مایع باشد، نتیجه یک سیستم کروماتوگرافی مایع خواهد بود. اگر فاز متحرک سیال فوق بحرانی باشد، کروماتوگرافی سیال فوق بحرانی نامیده می‌شود که این سیال از نظر حلالیت شبیه مایعات است و از نظر نفوذپذیری شبیه گازهاست. کروماتوگرافی سیال فوق بحرانی یک نوع هیبرید از کروماتوگرافی گازی و مایع است که بعضی از بهترین جنبه‌های هردو را ترکیب می‌کند.

اگر به‌طور خلاصه بخواهیم اشاره کنیم، در واقع کروماتوگرافی متکی بر حرکت نسبی دو فاز است. یکی از فازها بدون حرکت است و فاز ساکن نامیده می‌شود و دیگری را فاز متحرک می‌نامند. مخلوط نمونه بین دو فاز در بستر کروماتوگرافی (ستون یا صفحه) توزیع می‌شود.

در ادامه به بررسی کروماتوگرافی مایع با کارایی بالا می‌پردازیم.

 

کروماتوگرافی مایع با کارایی بالا

High Performance Liquid Chromatography technique

واژه‌ی کروماتوگرافی مایع، دربرگیرنده‌ی تکنیک‌های جداسازی مختلفی همچون کروماتوگرافی مایع- جامد، مایع- مایع، تبادل یونی و به‌دام اندازی بر اساس ابعاد ذرات می‌باشد که در تمامی آنها فاز متحرک مایع می‌باشد. در نوع کلاسیک کروماتوگرافی مایع، یک ستون شیشه‌ای با قطر بالا محتوی فاز ساکن وجود دارد که فاز متحرک با توجه به نیروی جاذبه از بین آن عبور می‌کند. این فرآیند نسبتاً آهسته بوده و آزمایش‌های مکرر با آن خسته‌کننده می‌باشد. از حدود سال ۱۹۶۹ میلادی، این روش با ساخت دستگاه کروماتوگرافی مایع با کارایی بالا- HPLC توسعه یافت.

کروماتوگرافی مایع با کارایی بالا روشی است توسعه یافته با مبنای کروماتوگرافی مایع که قطر ذرات داخل ستون‌های آن بسیار کوچک شده و جداسازی را بهتر انجام می‌دهند و همچنین در درون این سیستم‌ها، پمپ‌هایی وجود دارند که سرعت تعادلی مناسب ایجاد می‌نمایند. به‌طور کلی، استفاده از انواع آشکارسازهای اسپکتروفتومتری، فلوئوریمتری، الکتروشیمیایی، ضریب شکست و غیره و همچنین پیشرفت‌هایی که در ساخت ستون، پمپ و سایر تجهیزات HPLC پدید آمد، کارایی، سرعت جداسازی و دامنه کاربردهای این روش را به‌طور قابل ملاحظه‌ای افزایش داد.

در حال حاضر در میان روش‌های مختلف جداسازی تجزیه‌ای، کروماتوگرافی مایع با کارایی بالا از بیشترین رشد برخوردار می‌باشد. چنین رشد گسترده‌ای را می‌توان به توانایی این روش در جداسازی طیف وسیعی از مواد با نقطه جوش بالا و موادی که در اثر حرارت تجزیه می‌شوند، اندازه‌گیری‌های کمّی و صحیح، حساسیت، توانایی در جداسازی سریع مخلوط‌های پیچیده و کاربرد گسترده آن در زمینه موادی که از نظر صنعتی اهمیت دارند، نسبت داد. از میان موادی که به‌وسیله این روش مورد تجزیه قرار گرفته‌اند می‌توان به اسیدهای آمینه، پروتئین‌ها، اسیدهای نوکلئیک، هیدروکربن‌ها، کربوهیدرات‌ها، داروها، استروئیدها، آنتی‌بیوتیک‌ها و … اشاره نمود.

 

تجهیزات کروماتوگرافی مایع با کارایی بالا

به‌طور خلاصه و ساده می‌توان گفت:‌

جریانی از یک حلال به نام فاز متحرک،‌ از درون یک ستونِ پر شده به نام فاز ساکن عبور می‌کند و نمونه آزمایش از قسمت تزریق وارد ستون شده و اجزاء نمونه بر اساس ماهیت شیمیایی با فاصله زمانی متفاوتی از ستون شسته می‌شوند، سپس به‌وسیله آشکارساز شناسایی شده و نتایج به‌صورت پیک‌هایی به ثبت می‌رسد.

دستگاه HPLC، می‌تواند مجموعه‌ای از مدول‌ها یا اجزای سازنده جداگانه باشد، این در حالیست که می‌تواند به‌صورت یک دستگاه تک نیز طراحی شود. مفهوم مدول در مورد خرابی یک جزء سازنده‌ی تک، انعطاف‌پذیر است، به‌علاوه لزومی ندارد که قطعه‌های تک همه از یک سازنده‌ی دستگاه باشند. در صورتی که تمایل نداشته باشید خود تعمیرات جزئی را انجام دهید بهتر است یک دستگاه جمع‌وجور یکپارچه خریداری کنید. به‌هرحال این دستگاه فضایی کمتر از یک مجموعه مدولی را اشغال نخواهد کرد.

دستگاه HPLC شامل حداقل اجزای سازنده‌ای است که در شکل ۱ نشان داده شده‌اند:

الکتروفورز، کروماتوگرافی

شکل ۱. نمودار شمایی یک واحد HPLC

۱= مخزن حلال، ۲= خط انتقال با چینی متخلخل، ۳= پمپ (با فشارسنج)، ۴= تزریق نمونه،

۵= ستون (با دماپا)، ۶= آشکارساز، ۷= فاضلاب، ۸= کسب داده‌ها

 

مخزن حلال، خط انتقال با چینی متخلخل، پمپ با فشار زیاد، وسیله تزریق نمونه، ستون، آشکارساز و ثبات داده‌ها معمولاً همراه با ارزیابی داده‌ها. گرچه ستون مهم‌ترین قسمت است، ولی معمولاً کوچک‌ترین قطعه است. برای جداسازی‌های هم‌دما، ستون معمولاً در یک دماپا محبوس شده است. کاملاً متداول است بیش از یک حلال بکار بریم، بنابراین به یک مخلوط‌کن و کنترل‌کننده نیاز است. در صورتی که کسب داده‌ها با یک کامپیوتر انجام شود، آن‌را می‌توان برای کنترل کل سیستم نیز بکار گرفت.

هر قسمتی از سیستم که در تماس با فاز متحرک است باید از موادی ساخته شود که به‌وسیله حلال‌های مورد استفاده آسیب نبیند. قسمت‌هایی که در تماس با حلال هستند معمولاً از فولاد ضدزنــــــــــگ یا پلی‌‌ تترافلوئورواتیلن یا مواد دیگر مانند یاقوت کبود یا سرامیک ساخته شده‌اند، همچنین قسمت‌هایی نظیر خروجی پمپ تا انتهای ستون که معمولاً در معرض ایجاد فشار قوی قرار می‌گیرند باید آنقدر محکم باشند که تحمل فشار را داشته باشند. نکته مهم دیگر در طراحی دستگاه‌های HPLC این است که بین تزریق جسم و آشکار کردن آن باید حجم مرده به کمترین حد خود برسد. منظور از حجم مرده فضاهای خالی یا اشغال نشده می‌باشد. وجود حجم مرده زیاد سبب از دست دادن شدید کارایی سیستم می‌گردد. واضح است که ستون نیز در جاهایی که توسط فاز ساکن پر نشده دارای مقدار کمی حجم مرده است.

 

  • مخازن فاز متحرک و سیستم‌های مورد عمل قرار دادن حلال

یک دستگاه جدید HPLC به یک و یا تعداد بیشتری مخزن شیشه‌ای و یا فولاد زنگ‌نزن مجهز است که حاوی ۵۰۰ میلی‌لیتر و یا بیشتر از حلال است. مخازن اغلب به وسایلی برای حذف گازهای حل شده (معمولاً اکسیژن و نیتروژن) مجهزند. این گازها با تشکیل حباب‌ها سبب پهن شدن نوار پیک‌ها می‌شوند و علاوه بر این، اغلب با عملکرد آشکارساز تداخل می‌کنند. گاززداها ممکن است به یک سیستم پمپ خلأ، یک سیستم تقطیر، وسایلی برای گرم کردن و هم زدن حلال و همچنین به سیستم‌هایی برای وارد کردن و پاشیدن حباب‌های یک گاز بی‌اثر برای خارج کردن گازهای حل شده از محلول، مجهز ‌باشند. همچنین اغلب اوقات سیستم وسیله‌ای برای صاف کردن گردوغبار ذرات از حلال دارد تا از آسیب دیدن پمپ یا وسیله‌ی تزریق یا گرفتگی ستون به‌وسیله‌ی این ذرات جلوگیری شود. لزومی ندارد که گاززداها و صافی‌ها، جزء لاینفک دستگاه HPLC باشند. مثلاً، یک راه مناسب، آماده‌سازی حلال‌ها قبل از هدایت آنها به مخزن، صاف کردن حلال از داخل یک صافی ریزمنفذ در خلأ است. این آماده‌سازی، گازها و همچنین مواد معلق را حذف می‌کند.

 

  • سیستم‌های پمپ‌کننده

وظیفه اصلی پمپ در HPLC این است که فاز متحرک را با فشار بالا و با سرعت عبور کنترل شده، از ستون عبور دهد. یک نوع پمپ (پمپ با فشار ثابت)، این عمل را با وارد آوردن فشار ثابت به فاز متحرک انجام می‌دهد و سرعت عبور از ستون با توجه به مقاومت ستون در برابر عبور جریان و مقاومت‌های دیگر موجود بین پمپ و آشکارساز تعیین می‌شود. نوع دیگر (پمپ با جریان ثابت)، این کار را با عبور جریان در حد خواسته شده انجام می‌دهد و در اینجا میزان فشار با توجه به مقاومت در برابر عبور تنظیم می‌گردد. ممکن است مقاومت در برابر عبور در یک سیستم،‌ با زمان تغییر کند. این کار با ورم کردن یا نشت انباشته‌های ستون، تغییر درجه حرارت و یا تجمع ذرات خارجی موجود در نمونه، در پمپ و یا در واحد تزریق امکان‌پذیر است. اگر پمپی با فشار ثابت مورد استفاده قرار گیرد، به هنگام تغییر مقاومت در برابر عبور، سرعت عبور نیز تغییر خواهد کرد؛ اما در پمپ با جریان ثابت، تغییر مقاومت در برابر عبور، توسط تغییر فشار جبران می‌شود. تغییر در سرعت عبور سبب از دست دادن دقت و ایجاد خطوط پایه در دستگاه ثبات می‌شود.

علاوه بر اینکه پمپ باید قادر باشد تا فاز متحرک را در فشار بالا و با سرعت عبور یکنواخت از ستون عبور دهد، باید دارای خصوصیات زیر نیز باشد:

  1. قسمت‌های داخلی پمپ که در تماس با حلال‌ها هستند نباید به‌وسیله حلال‌های مورد استفاده آسیب‌دیده و فاسد شوند.
  2. پمپ باید قادر باشد تا گستره‌ای از سرعت عبور را فراهم آورد و ایجاد تغییر در سرعت عبور باید آسان باشد.
  3. عبور حلال باید بدون ضربان باشد.
  4. حجم درونی پمپ کم باشد تا تغییر فاز متحرک از یک نوع به نوع دیگر به‌آسانی امکان‌پذیر شود.
  5. پمپ باید به‌گونه‌ای باشد که تعمیر و جدا کردن آن از سیستم به‌آسانی میسر باشد.

لازم به ذکر است که فشار بالا به خودی خود چیزی نیست که در HPLC به دنبال آن هستیم. واقعیت این است که فاز متحرک، یک مایع است که برای عبور آن از درون یک بستر پرشده متراکم به فشار بالایی نیاز است. ذرات کوچک مسیرهای نفوذ کوتاهی دارند و بنابراین تعداد زیادی از بشقابک‌های نظری در واحد طول در اختیار می‌گذارند. در تئوری بشقابک‌های فرضی یا نظری (Plates) فرض می‌شود که هر ستون از یک سری لایه‌های باریک، افقی و کاملاً مجزا از هم که به‌طور متوالی قرار گرفته‌اند، تشکیل شده است. به هر یک از این لایه‌ها، بشقابک گفته می‌شود. در هرکدام از این بشقابک‌ها، آنالیت یا ماده‌ی مورد تجزیه در تعادلی بین فاز متحرک و ساکن قرار دارد و در نهایت با انتقال بین بشقابک‌ها عمل جداسازی صورت می‌پذیرد. کارایی هر ستون به تعداد بشقابک‌های موجود در ستون و یا به عبارت دیگر، به تعداد تعادل‌های ایجاد شده در ستون بستگی دارد؛ بنابراین برای بررسی کارایی ستون، تعداد بشقابک‌های فرضی (N) را از رابطه زیر محاسبه می‌کنند. در این رابطه H نشان‌دهنده ارتفاع هر بشقابک و L طول ستون را به نمایش می‌گذارد.

  • پمپ‌های با فشار ثابت

در اولین نوع پمپ‌های با فشار ثابت در HPLC (پمپ‌های حلقوی)،‌ گاز متراکم درون سیلندر با فشار زیاد فاز متحرک موجود در مسیر اتصال (بین مخزن حلال و ورودی ستون) را به درون ستون می‌راند. این نوع پمپ در انواع قدیمی HPLC استفاده می‌شد و هم‌اکنون تنها از جنبه تاریخی جالب است. پمپ‌های بادی از جمله پمپ‌های با فشار ثابت می‌باشند. اصول عملکرد پمپ‌های بادی تشدیدکننده در شکل ۲ زیر نشان داده شده است.

الکتروفورز، کروماتوگرافی

شکل ۲. پمپ بادی تشدیدکننده

 

  • پمپ‌های با جریان ثابت

در ‌HPLC دو نوع پمپ با جریان ثابت مورد استفاده قرار می‌گیرد.

در پمپ سرنگی (شکل ۳)،‌ فاز متحرک توسط یک اتاقک از یک موتور جدا می‌شود. این موتور با سرعت متفاوت پیچی را گردانده که آن نیز سبب گردش پیستون می‌شود. جریان در اینجا بدون نبض- Pulse است و می‌تواند با تغییر سرعت موتور تغییر پیدا کند. اتاقک در حدود ۲۰۰ تا ۵۰۰ سانتیمتر مکعب حجم دارد و ظرفیت فاز متحرک محدود به ظرفیت اتاقک است. اگرچه میزان حجم اتاقک زیاد است و قبل از پر کردن مجدد آن، تعداد زیادی نوار جذبی کروماتوگرافی می‌توان بدست آورد، اما زمانی که تغییر حلال لازم است برای خارج کردن آن از اتاقک، میزان زیادی حلال از بین می‌رود.

الکتروفورز، کروماتوگرافی

شکل ۳. پمپ سرنگی

 

نوع دیگر پمپ که در دستگاه‌ها مورد استفاده قرار می‌گیرد، پمپ متناوب می‌باشد که در شکل ۴ نشان داده شده است.

با استفاده از دنده یا گیره‌ی مختلف‌المرکز، پیستون به درون اتاقک حلال رفته و برمی‌گردد. در حرکت پیش‌برنده، شیر یک‌طرفه‌ی ورودی بسته شده و شیر یک‌طرفه خروجی باز می‌باشد لذا فاز متحرک به درون ستون می‌رود. در حرکت به عقب، شیر یک‌طرفه خروجی بسته و شیر‌ یک‌طرفه‌ی ورودی باز می‌شود تا اتاقک پر از حلال گردد. پمپ‌های متناوب برخلاف پمپ‌های سرنگی دارای ظرفیت نامحدود می‌باشند و حجم داخلی آنها می‌تواند خیلی کوچک باشد. سرعت جریان می‌تواند با تغییر طول پیستون و یا سرعت موتور تغییر کند و دسترسی به شیرها و مهره‌ها در این پمپ‌ها ساده می‌باشد.

در پمپ‌های متناوب یک‌دهانه‌ای (همانند شکل ۴) در ازای یک نیم‌دایره پمپ، فاز متحرک به درون ستون پمپاژ می‌شود و در ازای نیم‌دایره دیگر، اتاقک حلال پر می‌شود؛ بنابراین سرعت جریان همواره ثابت نیست؛ اما با استفاده از پمپ‌های متناوب دودهانه که دو دهانه با اختلاف فازِ برابر با ۱۸۰ درجه کار می‌کنند، زمانی که یک دهانه، حلال را به درون ستون می‌برد، دهانه دیگر در حال پر کردن اتاقک حلال خود می‌باشد، در نتیجه عملکرد دودهانه‌ای که ۱۸۰ درجه اختلاف فاز دارند سبب جریان بدون نبض می‌شود.

الکتروفورز، کروماتوگرافی

شکل ۴. پمپ متناوب

 

  • پمپ‌های پیستونی

این پمپ‌ها معمولاً از یک محفظه کوچک تشکیل شده‌اند که در آن حلال با حرکت رفت و برگشت یک پیستون توسط موتور پمپ می‌شود. دو شیر یک‌طرفه که به‌طور متناوب باز بسته می‌شوند، جریان حلال به داخل و به خارج از سیلندر را کنترل می‌کنند. حلال در تماس مستقیم با پیستون است یا اینکه ممکن است فشار از طریق یک دیافراگم انعطاف‌پذیر که خود نیز توسط یک پیستون رفت و برگشتی به طریق هیدرولیکی پمپ می‌شود، به حلال منتقل شود. از مزیت‌های پمپ‌های پیستونی می‌توان به حجم داخلی کوچک، فشارهای خروجی زیاد (تا ۱۰۰۰۰ psi) و سرعت جریان‌های ثابت اشاره کرد.

به‌طور کلی نیازمندی‌های مهم برای یک سیستم ‌پمپ‌کننده‌ی HPLC عبارتند از:

  1. تولید فشارهای تا ۶۰۰۰ psi
  2. خروجی بدون نبض یا ضربان- pulse
  3. سرعت جریان در گستره‌ی ۰/۱ تا ۱۰ (ml/min)
  4. اجزای سازنده‌ی مقاوم در مقابل خوردگی

 

  • سیستم تزریق نمونه

متداول‌ترین روش وارد کردن نمونه در کروماتوگرافی مایع که به‌طور گسترده‌ای مورد استفاده قرار می‌گیرد، توسط حلقه‌های نمونه‌بردار- loop/valve injector است. این وسایل اغلب از قسمت‌های اصلی دستگاه‌های HPLCاند و قابلیت تعویض‌پذیری دارند که انتخاب اندازه‌های نمونه از ۵ تا ۵۰۰ میکرولیتر را فراهم می‌آورند. این وسیله به‌منظور نگهداری و سپس ورود مقدار مشخصی از نمونه به درون فاز متحرک طراحی شده است. نمونه معمولاً توسط سرنگ و به‌صورت دستی و یا به‌صورت اتوماتیک از درون ویال‌ها به درون حلقه این وسیله وارد می‌شود. زمانی که لازم است تا تزریق صورت پذیرد، یک سوئیچ چرخشی حرکت می‌کند و جریان از درون حلقه حاوی نمونه عبور می‌کند.

 

  • ستون‌ و پیش‌ستون

ستون‌ها قلب کروماتوگرافی هستند و موفقیت یا عدم موفقیت یک آنالیز بستگی به انتخاب ستون دارد. جنس ستون‌ها معمولاً از فولاد ضدزنگ می‌باشد که با ماده پرکننده ستون پر شده است. این ماده پرکننده دو نوع می‌باشد:

  1. مواد غیرآلی سرامیکی مانند سیلیکا و آلومینا که دارای استحکام بالایی می‌باشند و در هر حلالی حل نمی‌شوند.
  2. پلیمرهای آلی که دو نوعِ پلی استایرن دی‌وینیل بنزن و همچنین متاکریلیت‌ها می‌باشند که نسبت به مواد غیرآلی استحکام کمتری دارند و زودتر فشرده می‌شوند، ضمن اینکه حلال‌ها با نفوذ در ماتریس پلیمری آنها باعث حل شدن (خوردگی) ذرات می‌شوند که نتیجتاً باعث پایین آمدن کارایی ستون با کاهش سرعت انتقال آنها می‌شود.

طول اکثر ستون‌های کروماتوگرافی مایع ‍۱۰ تا ۳۰ سانتی‌متر است. معمولاً ستون‌ها مستقیم‌اند و هر زمان که به طول‌های بیشتری احتیاج باشد، با متصل کردن دو یا چند ستون به یکدیگر، این کار انجام می‌شود. قطر داخلی ستون‌های مایع اغلب ۴ تا ۱۰ میلی‌متر است. متداول‌ترین اندازه ذرات پرکننده‌ها ۵ و ۱۰ میکرومتر است. بطورکلی می‌توان گفت که نام ستون‌ها بنا بر کارخانه سازنده، مختلف می‌باشد وگرنه همگی دارای خواص کاربردی تقریباً یکسانی هستند. در زیر چند گروه از ستون‌ها نام برده شده است:

  • ستون‌هایی که زنجیره‌هایی با ۸ کربن دارند (C8)
  • ستون‌هایی که زنجیره‌هایی با ۱۸ کربن دارند (C18)
  • ستون‌های سیلیکائی (SI)
  • ستون‌های با گروه آمینی (NH2-)
  • ستون‌هایی با گروه سیانو (CN-)
  • ستون‌هایی با گروه فنیلی (PHENYL)
  • ستون‌هایی با گروه دی‌الی (OH-)

اغلب، یک ستون کوتاه محافظ (پیش‌ستون) قبل از ستون تجزیه‌ای به کار می‌رود. این کار عمر ستون تجزیه‌ای را افزایش می‌دهد.

 

  • دماپای ستون

برای بسیاری از کاربردها، کنترل دقیق دمای ستون لازم نیست و ستون را می‌توان در دمای محیط بکاربرد. با وجود این، اغلب اوقات، با ثابت نگهداشتن دمای ستون تا چند دهم درجه سانتیگراد، کروماتوگرافی بهتری بدست می‌آید. اکثر دستگا‌ه‌های تجاری جدید امروزه به گرم‌کننده‌های ستونی مجهزند که دمای ستون را تا چند دهم درجه از نزدیک دمای محیط تا ۱۰۰ الی ۱۵۰ درجه سانتی‌گراد کنترل می‌کنند.

 

  • آشکارسازها

عامل وجودی آشکارساز در HPLC، آشکار کردن فاز متحرکی است که از ستون بیرون می‌‌آید؛ بنابراین، آشکارساز باید تغییر در ترکیب فاز متحرک را به طریقی نظارت و پایش و به یک علامت الکتریکی تبدیل کند. خروجی آشکارساز این علائم الکتریکی است که با خصوصیات فاز متحرک یا جزء نمونه متناسب است، سپس این علامت به ثبات یا صفحه نمایش انتقال می‌یابد که در آنجا به‌صورت انحرافی از خط مبنا نشان داده می‌شود. یک آشکارساز ایده‌ال باید مشخصات زیر را داشته باشد:

  • حساسیت کافی
  • پایداری خوب و تکرارپذیری
  • زمان عکس‌العمل کوتاه که مستقل از سرعت جریان است
  • قابلیت اعتماد بالا و سهولت کار
  • حجم مرده- Dead Volume پایین
  • حد تشخیص پایین (یعنی قادر باشد مقادیر کوچک نمونه را نظارت کند)
  • ارزان قیمت و دستکاری آن ساده باشد

به‌ندرت می‌توان آشکارسازی یافت که تمام موارد فوق را دارا باشد و می‌توان گفت که خصلت‌ها یا ویژگی‌های مختلف یک آشکارساز بر یکدیگر تأثیر می‌گذارند.

 

انواع آشکارسازها در HPLC به قرار زیرند:

  • آشکارسازهای جاذب ماوراء بنفش-UV
  • آشکارسازهای ضریب شکست
  • آشکارسازهای فلوئورسانی
  • آشکارسازهای الکتروشیمیایی
  • آشکارسازهای پراکندگی نور
  • آشکارسازهای رسانندگی
  • آشکارسازهای زیرقرمز (IR)
  • آشکارسازهای پرتوزایی

در این میان، آشکارسازهای جذب UV، عمومی‌ترین آشکارساز HPLC بشمار می‌روند؛ زیرا می‌توانند نسبتاً حساس باشند، گستره‌ی خطی وسیعی دارند و تا حد زیادی تحت تأثیر افت‌وخیزهای دما قرار نمی‌گیرند. اصول کارکرد این آشکارسازها بر این مبنا است که فاز متحرک از ستون به درون محفظه‌ای کوچک جاری می‌شود، محفظه در مقابل اشعه فرابنفش/ مرئی منتشرشده از دستگاه نورسنج یا طیف‌سنج قرار می‌گیرد. این آشکارسازها انتخابگر بوده و فقط می‌توانند اجزاء نمونه‌ای که نور فرابنفش یا مرئی را جذب می‌کنند، آشکار سازند؛ یعنی در صورتی که ملکول دارای حداقل یکی از موارد زیر باشد، جذب در طول‌موج بالای ۲۰۰ نانومتر صورت می‌گیرد.

  • برم، ید یا گوگرد
  • یک گروه کربونیل C=O یا گروه نیترو NO2
  • دو پیوند دوگانه مزدوج X=X-X=X
  • یک حلقه آروماتیک
  • یون‌های معدنی شامل: Br،I، NO3، NO2

به‌طور کلی آشکارسازهای جذب UV فقط در برخی مواد همچون آلکان‌ها، ترکیبات آروماتیک و ترکیبات دارای پیوند چندگانه که در داخل فاز متحرک جاذب نور ماوراء بنفش می‌باشند، انتخابی عمل می‌کنند.

آشکارسازهای ضریب شکست این مزیت مهم را دارند که نسبت به تمام مواد حل شده جواب می‌دهند. علاوه براین، این آشکارسازها اعتماد پذیرند و سرعت جریان بر آنها اثری ندارد. ضمن اینکه این آشکارسازها خیلی حساس به حرارت هستند.

امتیاز ذاتی آشکارسازهای فلوئورسانی حساسیت بالای آنهاست که نوعاً ده مرتبه یا بیشتر، بزرگ‌تر از آشکارسازهای جاذب ماوراء بنفش است. بااین‌حال این آشکارسازها نسبت به دیگر آشکارسازها کم مورد استفاده قرار می‌گیرند چون موادی که خاصیت فلورسانس داشته باشند، زیاد نیستند.

 

  • پردازشگر سیگنال

پردازشگرها شامل یک سیستم کامپیوتری می‌باشند که سیگنال‌های حاصل از آشکارساز را به شکلی که برای کاربر قابل استفاده باشد، تبدیل می‌کنند که حاصل این تبدیل به‌صورت کروماتوگرام نمایش داده می‌شود که متشکل از یک یا چند پیک می‌باشد که مساحت زیر پیک و ارتفاع پیک متناسب با غلظت آنالیت است. از این مسئله (مساحت زیر پیک و ارتفاع پیک) برای آنالیز کمی و از شکل و زمان پیک نیز برای آنالیز کیفی استفاده می‌شود.

 

انواع روش‌های کروماتوگرافی HPLC

چهار نوع مکانیزم یا فرآیند برای بازداری مولکول‌های نمونه توسط فاز ساکن وجود دارد. این چهار فرآیند باعث ایجاد چهار روش اساسی در کروماتوگرافی مایع می‌شود:

  • کروماتوگرافی تقسیمی

Partition chromatography

  • کروماتوگرافی جذبی

Absorption chromatography

  • کروماتوگرافی غربال ملکولی (ژلی)

Size exclusion chromatography

  • کروماتوگرافی تبادل یونی

Ion exchange chromatography

کروماتوگرافی تقسیمی در بین چهار روش فوق، بیشتر از همه بکار برده شده است. این روش شامل فاز ساکن می‌شود که نوع ترکیب آن، از فاز مایع در حال حرکت متفاوت است. مولکول‌های نمونه مورد آزمایش در این روش بین فازهای ساکن و متحرک توزیع می‌گردند. ضمن اینکه فاز ساکن و متحرک نباید قابل امتزاج در یکدیگر باشند.

در کروماتوگرافی غربال ملکولی، جداسازی مبتنی بر اَلَک کردن مولکولی بر روی اجسام بی‌بار در جریان مهاجرت الکترواسمزی از داخل ژل‌ها انجام می‌شود، بدین ترتیب که جداسازی بر مبنای اندازه‌های نسبی مولکول‌ها انجام شده و از اصطلاح صاف کردن به‌وسیله ژل استفاده می‌شود. ژل استفاده شده در این روش باید بی‌اثر و پایدار باشد. فاز ساکن از یک قالب متخلخل تشکیل شده که منفذهای آن به‌وسیله حلالی که فاز متحرک را تشکیل داده پر شده است. از آنجایی‌ که اساس جداسازی بر این مبناست که مولکول‌های بزرگ‌تر از حد وارد سوراخ‌ها نشده و به ترتیب جرم مولکولی از ستون خارج شوند و مولکول‌های کوچک‌تر برحسب شدت نفوذشان سوراخ‌ها را پر کنند، پس اندازه سوراخ بسیار مهم است. از دیگر عوامل مهم حجم نمونه است، بدین ترتیب که هر چه حجم نمونه کمتر باشد، غلظت هر جزء در محلول خارج‌شده نیز کمتر خواهد بود.

جهت جدا نمودن موادی که دارای بار الکتریکی می‌باشند می‌توان از کروماتوگرافی تبادل یونی استفاده نمود. در این حالت، ستون کروماتوگرافی دارای ذراتی با بار مثبت و منفی می‌باشد که عناصر باردار، نمونه مورد نظر را جذب می‌نمایند، لذا نمونه‌هایی که خارج می‌گردد، فاقد هرگونه ذرات باردار خواهد بود. ستون می‌تواند دارای یون مثبت یا منفی و یا هر دوی آنها باشد.

 

الکتروفورز

الکتروفورز در حقیقت نوعی کروماتوگرافی است که در دهه ۱۹۶۰ ارائه شد و جهشی بزرگ در توانایی جداسازی پروتئین‌ها بوجود آورد. توانایی جداسازی پروتئین‌ها با این روش، از روش‌های کروماتوگرافی بهتر است، به این معنی که پروتئین‌هایی با وزن مولکولی نزدیک به هم یا بار مشابه یکدیگر که جداسازی آنها با روش‌های قبلی ممکن نیست، با الکتروفورز تفکیک می‌شوند. این دستگاه برای اندازه‌گیری مقادیر کمی از انواع مختلف پروتئین‌های موجود در پلاسما، ادرار، مایع مغزی نخاعی و همچنین جدا کردن آنزیم‌ها و شناسایی آنتی‌بادی‌ها کاربرد دارد. اصطلاح الکتروفورز از دو عبارت الکترو (به معنای عملی که به‌وسیله الکتریسیته انجام می‌شود و حرکت ذرات باردار را موجب می‌شود) و اصطلاح فورز (به مفهوم حمل یا انتقال می‌باشد) تشکیل شده است، بنابراین اساس این روش حرکت و مهاجرت مولکول‌های حاوی بار الکتریکی در یک میدان الکتریکی است. این حرکت تا جایی ادامه می‌یابد که به نقطه ‌ایزوالکتریک جسم برسد. نقطه ایزوالکتریک یک مولکول عبارت است از pH مشخصی که در آن هیچ‌گونه حرکت الکتریکی از مولکول دیده نمی‌شود.

 

اصول و پایه فیزیکی الکتروفورز

حرکت یک فاز جامد در یک محلول در اثر اعمال میدان الکتریکی را روش الکتروفورز گویند که این محلول، بافر است و حمل جریان الکتریکی را برعهده دارد و از تغییرات pH نیز جلوگیری می‌کند.

یکی از روش‌های متداول الکتروفورز به نام الکتروفورز منطقه‌ای- electrophoresis  Zone معروف است. این روش بر اساس حرکت و مهاجرت مولکول‌های باردار به‌سوی قطب مخالف استوار می‌باشد. در این روش، وقتی نمونه بکار برده شده تحت تأثیر میدان الکتریکی قرار گیرد، با سرعت معینی حرکت کرده و بر اساس بار ذرات، در مناطق مختلف جداسازی انجام می‌پذیرد. جابجایی ذرات از طریق یک رابط صورت می‌گیرد و این رابط می‌تواند کاغذ، ژل، نشاسته، ژل آگارز، ژل آکریل آمید و استات سلولز باشد. حلال مورد استفاده (که عمدتاً بافر است) خاصیت آندواسمز دارد که فقط در خلاف جهت حرکت ذرات جابجا می‌شود. مثلاً پروتئین‌هایی که دارای بار الکتریکی منفی هستند، به‌طرف قطب مثبت حرکت می‌کنند.

عوامل مؤثر در تفکیک به‌وسیله الکتروفورز یا به بیانی دیگر فاکتورهایی که روی سرعت حرکت ذرات نمونه‌ی مورد بررسی اثر دارند، عبارتند از:

  • وزن مولکولی اجسام: هرچه جسم سبک‌تر باشد، در میدان الکتریکی سریع‌تر حرکت می‌کند و سرعت جداسازی بهتر می‌باشد.
  • شدت جریان: یعنی این‌که هرچه شدت جریان افزایش یابد، سرعت جابجا شدن و در نتیجه تفکیک و جداسازی نیز افزایش می‌یابد.
  • بار الکتریکی ذرات یا یون‌ها: هر چه ذرات یا یون‌های مورد آنالیز، بار الکتریکی بیشتری داشته باشند، سرعت جداسازی نیز بیشتر است. به‌طور کلی حرکت یک ذره، مستقیماً بستگی به بزرگی بار ذره دارد. یعنی تحرک ذرات- Mobility  به‌عنوان فاصله‌ای است که یک ذره در یک میدان قوی در مدت یک ثانیه طی می‌کند.
  • قدرت یونی بافر: غلظت زیاد بافر باعث می‌شود که سرعت حرکت ذرات کمتر باشد و این مربوط به اندرکنش بین یون‌های بافر و ذرات است. معمولاً از بافرهای باربیتال-Barbital که تک‌ظرفیتی هستند، استفاده می‌شود، زیرا کمترین واکنش را با پروتئین‌ها دارند. هر چه غلظت بافر کمتر باشد، جداسازی اجزاء نمونه بهتر صورت می‌گیرد.
  • دمای محیط: میزان حرکت ذرات، مستقیماً با دما متناسب است به‌طوری‌که در اثر عبور جریان از محیط و مقاومتی که در برابر جریان دارد، باعث تولید حرارت می‌شود. این پدیده دو اثر مهم روی الکتروفورز دارد؛ اولین اثر آن است که باعث افزایش دما شده و کاهش مقاومت را در پی دارد که باعث افزایش مهاجرت یون‌ها می‌شود. دومین اثر این است که گرما باعث تبخیر آب از سطح محیط می‌شود به‌طور عمده تغییرات درجه حرارت محیط می‌تواند بر روی جداسازی ذرات اثر گذاشته و معمولاً الکتروفورز می‌بایست در درجه حرارت ثابتی صورت گیرد.
  • جنس ماده مورد آنالیز: بر اساس نوع ماده مورد بررسی، انجام الکتروفورز و مدت زمان آن نیز متفاوت می‌باشد. فاصله مهاجرت ذرات، مستقیماً وابسته به زمان بدست آمده است. حتی می‌توان عنوان کرد که شکل ذرات نیز بر روی روش الکتروفورز اثر دارد.
  • PH محیط: چون PH بافر سبب تغییر بار الکتریکی پروتئین مورد آزمایش می‌شود، لذا بر روی سرعت جابجا شدن، اثر مستقیم دارد. دو عمل اصلی بافر: انتقال یونی (بافر باعث حمل جریان الکتریکی می‌شود) و اینکه بافر با ثابت نگه داشتن PH، بار مولکول‌ها یا یون‌ها را تأمین می‌کند.

به عبارت دیگر PH محلول در حین مهاجرت یون‌ها ثابت می‌ماند. هر چه غلظت یونی بافر بیشتر باشد، حرکت یون‌ها بهتر صورت می‌گیرد و نهایتاً جداسازی دقیق‌تر می‌باشد.

با کاهش قدرت یونیک، سرعت جابجایی ذرات افزایش می‌یابد. در اسیدهای آمینه، پپتیدها و پروتئین‌ها، pH اثر زیادی روی سرعت جابجا شدن دارد، یعنی اگر pH بافر کمتر از pH نمونه مورد آزمایش باشد، محلول بار الکتریکی مثبت پیدا کرده و به سمت قطب منفی حرکت می‌نماید و در حالت معکوس به سمت قطب مثبت حرکت می‌کند. قابلیت تحرک یک جزء پروتئین روی حامل متخلخل، مانند کاغذ از نظر قدرت یونیک به رابطه زیر بستگی دارد:

که در این رابطه n غلظت محلول، d ضخامت دی‌الکتریک، r شعاع جزء و Q بار خالص الکتریکی پروتئین مربوطه می‌باشد.

در کنار نیروی الکتروفورتیک، نیروی الکترواسموتیک نیز هست که ناشی از ایجاد یک بار منفی است که در نتیجه مقاومت کاغذ در برابر محلول بافر بوجود می‌آید، بنابراین در پروتئین‌ها، pH اثر زیادی روی سرعت جابجا شدن دارد، یعنی اگر pH بافر کمتر از pH جسم باشد، در قدرت الکترواسموتیک بافر که مثبت است و به سمت قطب منفی کشیده می‌شود، وقفه ایجاد می‌کند؛ به عبارتی دیگر کاغذ صافی با جابجا شدن پروتئین‌ها به سمت قطب مثبت، در تضاد است. یعنی نیروی الکترواسموتیک مانع انجام عمل الکتروفورز می‌شود. برای این منظور، کاغذ را کلفت انتخاب می‌کنند تا اینکه مقاومتش در برابر خیس شدن زیاد شود و دارای قدرت مکش ضعیف باشد، بدین معنی که قدرت موئینگی در آن کم باشد. ضمناً با اعمال بار مثبت به کاغذ اثر الکترواسموتیک را کاهش می‌دهند.

اثر مزاحم دیگر، تغییرات حرارت در طی عمل تفکیک سازی توسط الکتروفورز است که باعث تغییر بافر و در نتیجه ایجاد حرکاتی در روی باندهای جدا شده می‌شود.

شکل ۵ نمایی از یک الکتروفورز را نشان می‌دهد. برای انجام آزمایش، نمونه را روی یک پل ارتباطی قرار داده و سپس دستگاه را به جریان الکتریکی وصل کرده که با این عمل دستگاه شروع به‌ کار می‌کند. بعد از اتمام آنالیز، آن را خاموش کرده و محیط را برداشته و فیکس کرده و پس از فیکس کردن آن را شفاف نموده و سپس در دانسیتومتر قرار می‌دهند. دانسیتومتر شامل یک چشمه نور، یک فیلتر و یک آشکارساز از نوع دیود نوری می‌باشد. در دانسیتومتر بر اساس دانسیته ذرات، عمل جداسازی صورت می‌گیرد و سپس توسط ثبت‌کننده، مقدار اجزاء ترکیب بر اساس فاصله جدایی‌شان روی یک منحنی ثبت می‌شوند. یک دستگاه الکتروفورز چنانچه در شکل ۵ نیز مشاهده می‌شود، شامل اجزاء زیر است:

  1. دستگاه تنظیم جریان الکتریسیته: جریان الکتریکی لازم برای انجام عمل جداسازی ذرات توسط این قسمت تهیه می‌شود.
  2. اتاقک تفکیک: این قسمت محیطی است که به‌عنوان پل ارتباطی عمل کرده و جداسازی اجزاء نمونه روی آن انجام می‌شود.
  3. دانسیتومتر فتوالکتریک: دستگاهی است که درجه شفافیت نور را میلی‌متر به میلی‌متر نشان می‌دهد و میزان شدت عبور را نیز مشخص می‌نماید (نوار کاغذ را پس از اتمام تفکیک باید شفاف ساخته، بین دو صفحه شیشه‌ای قرار داده و وارد دستگاه دانسیتومتر کرد).

الکتروفورز، کروماتوگرافی

شکل ۵: شمای کلی یک دستگاه الکتروفورز و قسمت‌های آن

 

روش‌های الکتروفورز بر اساس نوع محیط بکار برده شده، برای جداسازی مواد به انواع مختلف تقسیم می‌شوند. برخی از انواع آن که بیشتر در آزمایشگاه‌ها کاربرد دارند، به شرح زیر می‌باشد:

 

۱: الکتروفورز کاغذی

ElectrophoresisPaper

در این نوع الکتروفورز، از کاغذ به‌عنوان محیط جداسازی استفاده شده و پس از عمل الکتروفورز، کاغذ را بیرون آورده و آن را خشک نموده و سپس توسط نین‌هیدرین -Ninhydrine، رنگ‌آمیزی اختصاصی می‌شود. پس از آن کاغذ را به دانسیتومتر می‌دهند. در بعضی دستگاه‌های دانسیتومتری، کاغذ را بر اساس نوارها جدا کرده (کاغذ را تکه‌تکه کرده، طوری که هر نوار روی یک کاغذ باشد) و به‌صورت پودر درآورده و سپس به دستگاه جهت آنالیز می‌دهند. از مزایای این روش، قدرت کشش خوب جهت جداسازی ذرات، مقرون به‌صرفه بودن و کار کردن آسان با آن را می‌توان نام برد. از معایب این روش، مدت زمان زیادی است که برای جدا شدن ذرات نیاز دارد و همچنین مقاومت کم کاغذ در مقابل خیس شدن را می‌توان ذکر کرد.

 

۲: الکتروفورز با ژل آگاروز

Agarose Gel Electrophoresis

برای تهیه این ژل حدود ۰/۵ تا ۱ گرم پودر آگاروز را در یک دسی لیتر آب حل کرده و صبر کرده تا اشباع شود. در بیشتر اوقات آن را در بافر حل می‌کنند و سپس آن را در ظرف قرار داده و حفره‌های کوچکی را به‌صورت نقطه‌ای روی آن ایجاد می‌نمایند که به آنها چاه- Well می‌گویند.

ژل آگاروز واکنش بسیار ضعیفی با پروتئین انجام می‌دهد و پروتئین راحت‌تر روی آن حرکت می‌کند. از این ‌روش بیشتر در آنالیز پروتئین‌ها، انواع هموگلوبین، ایزوآنزیم‌ها و اجزاء لیپوپروتئین و دیگر مواد سرم استفاده می‌شود. در این روش، مقادیر بسیار ناچیز نمونه به کار برده می‌شود و زمان نسبتاً کوتاهی (تقریباً ۳۰ تا ۹۰ دقیقه) برای جداسازی لازم است.

 

۳: الکتروفورز با استات سلولز

Cellulose Acetate Electrophoresis

این ژل با استفاده از ترکیب هیدروکسیل استات با استات بدون آب تهیه می‌شود؛ یعنی حدود ۰/۳ تا ۲ میکرولیتر از نمونه برای جداسازی نیاز می‌باشد. در این روش، سرعت جداسازی در حدود ۲۰ دقیقه است و از مزایای دیگر آن پایداری غشاء برای نگهداری نمونه در مدت زمان طولانی می‌باشد. معمولاً در روش‌های الکتروفورز، بیشتر استات سلولز مورد استفاده قرار می‌گیرد، زیرا در مقایسه با کاغذ، محاسن بیشتری دارد و از این برتری‌ها، مقادیر خیلی کوچک از نمونه، زمان کوتاه جداسازی (حدود ۱۵ تا ۲۰ دقیقه)، تفکیک خوب بین باندهای مختلف و شفافیت کامل بعد از رنگ‌آمیزی را می‌توان نام برد.

 

۴: الکتروفورز با ژل پلی‌اکریل آمید

Polyacryl Amide Gel Electrophoresis

این ژل را معمولاً به‌صورت دو ژل، یکی با منافذ کوچک و دیگری با منافذ بزرگ‌تر تهیه می‌نمایند. هنگامی که نمونه را روی ژل قرار می‌دهند، ابتدا نمونه از قسمت ژل با منافذ بزرگ‌تر عبور نموده تا اینکه به فصل مشترک دو ژل برسد. بدیهی است که نمونه‌های با اندازه‌های کوچک‌تر، از قسمت ژل با منافذ بزرگ‌تر عبور کرده و یک غربال روی نمونه انجام می‌شود. پروتئین‌های با اندازه‌های بزرگ‌تر به‌راحتی نمی‌توانند از ژل عبور کرده و مخصوصاً عبور آنها از منافذ کوچک‌تر انجام نمی‌پذیرد. تعداد باندهای ایجاد شده توسط این روش، بسیار بیشتر از روش‌های قبلی است، دلیل آن این است که مولکول‌های بزرگ‌تر، بار الکتریکی بیشتری دارند و می‌خواهند زودتر طول مسیر ژل را بپیمایند ولی منافذ کوچک، جلو حرکت آنها را می‌گیرند. از طرفی نیز مولکول‌های با اندازه کوچک‌تر که بار الکتریکی کمتری دارند به علت اندازه‌شان، سریع‌تر عبور کرده و باندهای بیشتری را ایجاد می‌نمایند.

برای تهیه این ژل، لوله‌هایی که سر و ته آنها باز می‌باشد (حدود ۶ تا ۷ لوله) را در جایی قرار می‌دهند که وقتی آب به داخل آنها ریخته شود، نتواند بیرون بیاید. ابتدا ژل با منافذ کوچک را تهیه کرده و قسمتی از آن را درون هرکدام از لوله‌ها ریخته و حــدود نیم ساعت تحت نور آفتاب یا ماورای‌ بنفش قــــرار داده تا پلیمریزه-  Polymerize شود که در این صورت سفت می‌شود. سپس ژل با منافذ بزرگ‌تر را نیز تهیه کرده و درون لوله‌ها قرار می‌دهند و بعد آن را در معرض نور آفتاب قرار داده تا اینکه سفت شود. پس از آن لوله‌ها را داخل محفظه‌هایی که به هم متصل شده‌اند و محلی برای جاسازی آنها وجود دارد، قرار داده و درون تانک را تا نصفه بافر می‌ریزند. با قرار دادن نمونه در درون لوله‌ها برای تمامی لوله‌ها مقدار ماده رنگی شیمیایی که معمولاً متیلن آبی– Methylen Blue است ریخته و سپس تانک بالایی را نیز بافر می‌ریزند تا اینکه بافر تمامی لوله‌ها را دربرگیرد و آن را برای آنالیز مهیا می‌کنند.

با شروع عمل الکتروفورز، مسلم است که پروتئین‌ها به‌طرف پایین حرکت کرده و ماده رنگی نیز همراه پروتئین‌ها حرکت می‌کند و به اپراتور کمک می‌کند که موقعیت پروتئین‌ها را مشاهده نماید، به‌طوری که در تانک پایینی نریزد. سپس لوله‌ها را بیرون آورده و ژل را از لوله خارج می‌کنند و پس از عمل شستشو و رنگ‌آمیزی، تعداد باندها یا نوارها مشخص خواهد شد. حدود بیست نوار توسط این روش حاصل می‌شود. در صورتی که توسط روش‌های قبلی تعداد نوارها برای پروتئین، حدود هفت نوار می‌بود.

جدا کردن با ژل اکریل آمید در حقیقت تلفیق الکتروفورز و صاف کردن روی ژل است. در عمل مشاهده می‌شود که ارتباط خطی بین میزان حرکت و لگاریتم وزن مولکولی پروتئین‌ها وجود دارد، ازاین‌رو الکتروفورز روی ژل‌های پلی‌اکریل آمید نه تنها جداسازی بهینه پروتئین‌ها را ممکن می‌سازد، بلکه روش خوبی برای تعیین وزن مولکولی آنها نیز می‌باشد. از مزایای این روش مقاومت آن در مقابل دما، شفافیت ژل و تغییر اندازه منافذ ژل می‌باشد.

 

۵: الکتروفورز با ژل نشاسته

در این روش از نشاسته استفاده می‌شود که کاملاً هیدرولیز شده و معمولاً ماکرومولکول‌ها بر اساس اندازه‌شان جدا می‌شوند.

 

۶: الکتروفورز در میدان الکتریکی ضربان‌دار

با توجه به اینکه هرچه غلظت ژل کمتر باشد مولکول‌های بزرگ‌تری را می‌توان به‌وسیله الکتروفورز تفکیک نمود ولی چون میزان این رقت دارای محدودیت است، بطوریکه حتی با رقیق‌ترین ژل‌های آگارز هم نمی‌توان به‌عنوان مثال مولکول‌های DNA بزرگ‌تر از ۱۰۰ کیلو جفت باز (kilo base pair = kbp) را تفکیک نمود، لذا برای این منظور از روش‌های الکتروفورز در میدان الکتریکی ضربان‌دار استفاده می‌شود که دارای انواع مختلفی می‌باشد:

 

  • الکتروفورز در میدان الکتریکی ضربان‌دار تک‌جهتی

یکی از ساده‌ترین روش‌های الکتروفورز در میدان الکتریکی ضربان‌دار، روش میدان الکتریکی ضربان‌دار تک‌جهتی با استفاده از یک دستگاه ژل الکتروفورز افقی معمولی می‌باشد. با استفاده از میدان الکتریکی ضربان‌دار تک‌جهتی می‌توان مولکول‌هایی به‌اندازه ۴۰۰ کیلو جفت باز را از هم تفکیک نمود. در این روش میدان الکتریکی در فواصل زمانی معین قطع شده و مجدداً برقرار می‌گردد. هنگامی که میدان برقرار است ملکول DNA در جهت میدان حرکت نموده و به‌صورت گسترده درمی‌آید. با قطع جریان الکتریکی، حرکت DNA متوقف شده و در این حالت ملکول فرصت می‌یابد تا به حالت شکل فضایی خاص خود برگردد ولی با برقراری مجدد جریان حرکت ملکول مجدداً آغاز می‌شود. با اعمال چنین میدان الکتریکی همه مولکول‌ها فرصت نمی‌یابند تا به‌طور کامل به شکل فضایی خود درآیند. البته هر چه ملکول کوچک‌تر باشد سریع‌تر می‌تواند به شکل فضایی خود برگردد و یا از آن خارج شود، این در حالی است که ملکول‌های بزرگ‌تر نمی‌توانند و بر این اساس می‌توان مولکول‌های نسبتاً بزرگ را از هم تفکیک نمود. این روشِ الکتروفورز در آنالیز ژن‌های بزرگ نظیر ژن کدکننده پروتئین دیستروفین که در پیدایش بیماری دیستروفی عضلانی نقش دارد، مورد استفاده قرار می‌گیرد.

 

  • ژل الکتروفورز در میدان الکتریکی معکوس

با این روش می‌توان مولکول‌هایی تا اندازه ۸۰۰ کیلو جفت باز را تفکیک نمود. در این روش، جهت میدان الکتریکی در فواصل زمانی معین معکوس می‌شود؛ به این صورت که برای تفکیک مولکول‌های کوچک از دامنه‌های زمانی کمِ میدان الکتریکی یعنی ۰/۵ ثانیه در جهت مستقیم و ۰/۲۵ ثانیه در جهت مخالف و در مورد مولکول‌های بزرگ‌تر از دامنه زمانی بیشتر یعنی ۳ ثانیه در جهت مستقیم و ۱ ثانیه در جهت مخالف به‌طور متناوب استفاده می‌شود.

 

  • ژل الکتروفورز در میدان الکتریکی ضربان‌دار

ژل الکتروفورز در میدان الکتریکی ضربان‌دار یکی از متداول‌ترین روش‌های الکتروفورز در میدان الکتریکی ضربان‌دار می‌باشد. با استفاده از روش ژل الکتروفورز در میدان الکتریکی ضربان‌دار می‌توان ملکول‌های بسیار بزرگی در اندازه‌های بین ۲۰ هزار تا ۲ میلیون جفت باز را تفکیک نمود. در این روش از دو میدان الکتریکی که نسبت به هم به‌صورت عمود قرار گرفته‌اند در فواصل زمانی معین و به‌طور متناوب استفاده می‌شود. یکی از این میدان‌ها در جهت بالا به پایین و دیگری در جهت چپ به راست برقرار می‌شود. مولکول‌های DNA تحت تأثیر میدان اول به حرکت درآمده و پس از آن تحت تأثیر میدان دوم ۹۰ درجه تغییر جهت می‌دهند. با این روش مولکول‌های DNA با حرکت چرخشی خود در طول ژل به‌صورت زیگ-زاگ به حرکت در می‌آیند.

 

۷: الکتروفورز دوبعدی

معرفی الکتروفورز دوبعدی توسط اوفارل- O’Farrell در سال ۱۹۷۵ برای جداسازی پروتئین‌های سلولی، امکان تفکیک صدها پروتئین را فراهم کرد و مبنای الکتروفورز ژل پلی‌آکریل آمید دوبعدی مدرن امروزی شد. الکتروفورز دوبعدی می‌تواند به‌طور مؤثر در یک ترکیب بیولوژی، هزاران پروتئین را بر اساس دو خاصیت مستقل تفکیک کند که این دو خاصیت عبارتند از: نقطه ایزوالکتریک و وزن ملکولی

پروتئین‌ها در بعد اول با تکنیک متمرکز کردن ایزوالکتریکی بر اساس نقطه ایزوالکتریک خود جداسازی می‌شوند و در بعد دوم با تکنیک الکتروفورز ژل پلی‌آکریل آمید بر اساس وزن ملکولی تفکیک می‌شوند.

ضعف الکتروفورز ژل دوبعدی اولیه تکرارپذیری ضعیف و ظرفیت بارگیری کم است. برای حل این مشکل و امکان تفکیک تعداد بیشتری پروتئین، مفهوم گرادیان PH غیرقابل حرکت- Immobilized PHGradients یا به‌اختصار IPG معرفی شد. در IPG، آمفولیت‌های حمل‌کننده– ampholyte به مولکول‌های آکریل آمید می‌چسبند و به داخل ژل‌ها ریخته می‌شوند تا گرادیان PH را که ثابت است، فرم دهند. این کار از رانش در ژل جلوگیری می‌کند و می‌توان اطمینان داشت که تولید مجدد ژل امکان‌پذیر است.

 

۸: الکتروفورز متمرکز کردن ایزوالکتریکی

تکنیک متمرکز کردن ایزوالکتریکی-Isoeletric Focusing نوعی الکتروفورز می‌باشد که برای مشخص کردن PH ایزوالکتریک پروتئین‌ها و جدا کردن آنها بر مبنای تفاوت‌های موجود بین نقطه ایزوالکتریک آنها بکار گرفته می‌شود. برای تمرکز ایزوالکتریکی از ستون شیشه‌ای که توسط محلول آمفولیت‌هایی که به‌طور مصنوعی به آن بار الکتریکی داده‌ایم و دارای محدوده وسیع و ممتدی از نقاط ایزوالکتریک می‌باشند، استفاده می‌گردد. در دو انتهای ستون، الکترودها در محلولی که معمولاً برای کاتد یک باز آلی قوی و برای آند یک اسید قوی در نظر گرفته می‌شود، قرار دارند. زمانی که پتانسیل الکتریکی بین دو الکترود برقرار می‌گردد، آمفولیت‌های موجود در ستون به حرکت در می‌آیند و در جایی که جاذبه متساوی توسط هردو الکترود داشته باشند، تجمع می‌یابند؛ بنابراین می‌توان گفت که آنها خود را بر اساس نقطه ایزوالکتریکشان مرتب می‌کنند. اسیدی‌ترین آمفولیت‌ها نزدیک آند و بازی‌ترین آنها نزدیک کاتد متمرکز می‌گردد و بدین ترتیب یک شیب PH در طول ستون ایجاد می‌شود که از طرف آند به کاتد افزایش می‌یابد. بر مبنای PH محلول اطراف و ماهیت زنجیره‌های جانبی اسیدهای آمینه موجود، هر پروتئین یک بار خالص که مشخصه پروتئین در آن PH می‌باشد را کسب می‌کند. پروتئین‌های نزدیک به آند دارای بار خالص مثبت خواهند بود بنابراین توسط آن الکترود دفع می‌شوند. پروتئین‌های نزدیک به کاتد هم دارای بار خالص منفی بوده و دفع می‌شوند، درنتیجه اکثر پروتئین‌ها از هر دو قطب دور شده و به‌طرف مرکز ستون مهاجرت می‌کنند. در خلال این مهاجرت، پروتئین‌ها از شیب PH ایجاد شده عبور کرده و بار موجود در زنجیره‌های جانبی اسیدهای آمینه آنها تغییر می‌کند. پروتئین‌هایی که از آند دور می‌شوند به‌تدریج بار مثبت آنها کاهش می‌یابد درصورتی‌که پروتئین‌هایی که در حال دور شدن از کاتد می‌باشند به‌تدریج از بار منفی آنها کاسته می‌شود. نهایتاً در نقطه بخصوصی بار خالص پروتئین صفر می‌گردد که این همان نقطه ایزوالکتریک می‌باشد. در این نقطه دیگر پروتئین تحرکی نداشته و ثابت و ساکن می‌شود. زمانی که مهاجرت تمامی پروتئین‌ها خاتمه یافت، محتویات ستون را تخلیه نموده و پروتئین‌های تفکیک‌شده را برای مطالعات بعدی مورد استفاده قرار می‌دهند.

 

۹: روش کاپیلاری الکتروفورز

روش کاپیلاری الکتروفورز در سال ٢٠٠٧ برای شناسایی اختلالات هموگلوبینی توسط اداره غذا و دارو آمریکا مورد تأیید قرار گرفت. در این روش، فرایند الکتروفورز در بافر قلیایی با pH  برابر با ۴/۹ در کاپیلاری‌های سیلیکونی با قطر داخلی ۵۰ میکرومتر انجام می‌گیرد، بدین‌صورت که نمونه‌ها به یک طرف کاپیلاری تزریق شده و پروتئین‌ها در شرایط ولتاژ بالا به‌طرف دیگر حرکت می‌کنند تا بر اساس PH بافر، PH ایزوالکتریک و جریان اندوسمزی جدا شوند. در این روش هموگلوبین A2 در حضور هموگلوبین E قابل اندازه‌گیری است اما جداسازی هموگلوبین A2 در حضور هموگلوبین C و O دشوار است و افزایش کاذب هموگلوبین A2 در بیماران با هموگلوبین C به دلیل حرکت مشابه اتفاق می‌افتد. میزان هموگلوبین F در بیماران دارای هموگلوبین S به روش کاپیلاری الکتروفورز افزایش کاذب نسبت به روش کروماتوگرافی مایع با کارایی بالا دارد که احتمالاً به دلیل مهاجرت هموگلوبین S تخریب‌شده همراه با هموگلوبین F می‌باشد. در این روش حرکت هموگلوبین‌ها بر اساس حرکت هموگلوبین‌های A و A2 تعیین می‌شوند در نتیجه در بیمارانی که هموگلوبین A وجود ندارد (در حالت هموزیگوت و هتروزیگوت ترکیبی اختلالات هموگلوبینی) جهت تعیین جایگاه هموگلوبین‌های بیمار بایستی نمونه بیمار با یک نمونه طبیعی به نسبت برابر مخلوط شود.

یکی از مزایای اصلی کروماتوگرافی مایع با کارایی بالا به روش کاپیلاری الکتروفورز وجود الگوهای کروماتوگرافی مربوط به هموگلوبین‌های نادر می‌باشد. از روش کاپیلاری الکتروفورز می‌توان به‌عنوان روش مکمل کروماتوگرافی مایع با کارایی بالا استفاده نمود. مطالعات مختلفی جهت مقایسه این دو روش برای آنالیز هموگلوبین‌های با اهمیت از جمله A، A2، S، C و E انجام شده است. از مزایای روش کاپیلاری الکتروفورز عدم نیاز به کالیبراسیون است. همچنین الکتروفوروگرام‌های مربوط به کاپیلاری الکتروفورز برای آنالیز هموگلوبین واضح‌تر و مشخص‌تر هستند، از طرفی کاپیلاری الکتروفورز دارای قدرت تشخیص هموگلوبین بارت (Bart) از مواد مداخله‌گر مانند بیلی‌روبین می‌باشد.

از روش کاپیلاری الکتروفورز جهت تشخیص هموگلوبین S، بتا تالاسمی‌های ماژور، اینترمدیا و مینور و سایر اختلالات هموگلوبینی جهت غربالگری نوزادان استفاده می‌شود که یک روش معتبر برای غربالگری در نمونه خون تازه و خشک‌‌شده در نوزادان می‌باشد. البته برای نوزادان از روش ایزوالکتریک فوکوسینگ و کروماتوگرافی مایع با کارایی بالا نیز می‌توان استفاده کرد.

روش کاپیلاری الکتروفورز خیلی سریع بوده و آنالیز هشت نمونه را در مدت هفت دقیقه انجام می‌دهد. هر کاپیلاری سیلیکونی را می‌توان حدود ٣٠٠٠ بار استفاده کرد، در نتیجه یک روش باصرفه و کم‌هزینه می‌باشد.

انواع واریانت‌های-  Variantsهموگلوبین در ١۵ قسمت- Zone با روش کاپیلاری الکتروفورز قرار می‌گیرند، از آنجایی که این روش توانایی جداسازی حداقل ١٨٠ واریانت هموگلوبین را دارد، بنابراین در هر قسمت ممکن است چندین هموگلوبین مختلف قرار گیرد. در نتیجه برای شناسایی هموگلوبین واقعی بایستی تست تکمیلی بیوشیمیایی و یا یک تکنیک متفاوت انجام گیرد و در نهایت جهت تأیید قطعی از تست مولکولی استفاده شود (۵ و ۷ و ۸ و ۹ و ۱۰).

 

برخی از منابع

  1. بهزاد حسینی‌پور، «بهینه‌سازی شرایط به‌منظور جداسازی، تشخیص و اندازه‌گیری مشتق برم‌‌دار گاما بوتیرولاکتون در محیط سنتز به‌وسیله تکنیک کروماتوگرافی مایع با کارایی بالای فاز معکوس (HPLC) با دتکتور فرابنفش (UV)»، پایان‌نامه کارشناسی ارشد شیمی تجزیه، دانشگاه بین‌المللی امام خمینی
  2. محمد کریمی، «شناسایی همزمان بنزودیازپین‌ها در بعضی نوشیدنی‌های غیرالکلی با روش کروماتوگرافی مایع با کارکرد عالی»، پایان‌نامه کارشناسی ارشد در رشته سم‌شناسی دانشگاه تربیت مدرس
  3. زهره‌سادات حسینی‌فرد، «آنالیز سفوروکسیم سدیم در نمونه‌های دارویی با استفاده از جاذب‌های نوین و کروماتوگرافی مایع با کارایی بالا»، پایان‌نامه کارشناسی ارشد شیمی تجزیه، دانشگاه آزاد واحد تهران مرکزی
  4. محسن کرمی، «میکرواستخراج پخشی داروی کلوزاپین و اندازه‌گیری آن توسط HPLC در ماتریکس دارویی»، پایان‌نامه کارشناسی ارشد شیمی کاربردی دانشگاه آزاد واحد تهران مرکزی
  5. علیرضا ابراهیمی و همکاران، استفاده از روش کاپیلاری الکتروفورز جهت غربالگری اختلالات هموگلوبینی شایع در ایران، مجله دانشکده پزشکی، دانشگاه علوم پزشکی تهران، خرداد ١٣٩۵، دوره ٧۴، شماره ٣، صفحه‌های ١۴٧ تا ١۵٨
  6. کتاب اصول فیزیکی دستگاه‌های آزمایشگاهی، دکتر داریوش شهبازی گهرویی
  7. Greene DN, Vaughn CP, Crews BO, Agarwal AM. Advances in detection of hemoglobinopathies. Clin Chim Acta 2015;439:50-7.
  8. Winichagoon P, Svasti S, Munkongdee T, Chaiya W, Boonmongkol P, Chantrakul N, et al. Rapid diagnosis of thalassemias and other hemoglobinopathies by capillary electrophoresis system. Transl Res 2008;152(4):178-84
  9. Giambona A, Passarello C, Renda D, Maggio A. The significance of the hemoglobin A(2) value in screening for hemoglobinopathies. Clin Biochem 2009;42(18):1786-96.
  10. Greene DN, Pyle AL, Chang JS, Hoke C, Lorey T. Comparison of Sebia Capillarys Flex capillary electrophoresis with the BioRad Variant II high pressure liquid chromatography in the evaluation of hemoglobinopathies. Clin Chim Acta 2012;413(15-16):1232-8.

کروماتوگرافی مایع با کارآیی بالای دناتوره

آشنایی با کروماتوگرافی با کارایی بالا  HPLC و کاربردهای آن

برای دانلود پی دی اف بر روی لینک زیر کلیک کنید

برچسبها
  • الکتروفورز
  • کروماتوگرافی
  • مهندس احسان درخشان نیا

دیدگاهتان را بنویسید

نشانی ایمیل شما منتشر نخواهد شد. بخش‌های موردنیاز علامت‌گذاری شده‌اند *