کاهش ۷۰ درصدی خطاهای آزمایشگاهی با دانستنی‌های قبل از آنالیز ۷

 

دکتر حبیب‌اله گل‌افشان، عضو هیئت علمی دانشگاه علوم پزشکی شیراز

 

طرز نگهداری نوارهای ادرار و منابع خطا در واکنش‌های رنگی آن

قسمت هفتم

 

اسمولالیتی و وزن مخصوص

اسمولالیتی و وزن مخصوص ادرار بازتابی از غلظت مواد حل شده در ادرار است، اما حاوی اطلاعات یکسان نمی‌باشند. اسمولالیتی در ارتباط با تعداد یون‌ها در ادرار بوده در حالی که وزن مخصوص نه تنها به تعداد یون‌ها، بلکه با وزن مولکولی آنها نیز رابطه دارد. اســــــمولالیتی بازتاب بهتری از قدرت رقیق سازی و غلیظ سازی ادرار بدست می‌دهد، زیرا تحت اثر موادی مانند گلوکز، پروتئین، دکستران و ماده حاجب عکسبرداری قرار نمی‌گیرد. وزن مخصوص و اسمولالیتی دارای یک رابطه خطی هستند؛ بدین مفهوم که هر واحد وزن مخصوص تقریباً معادل mosm40 (میلی اسمول) است؛ برای مثال وزن مخصوص‌های ۱/۰۱۰ و ۱/۰۲۰ و ۱/۰۳۰به ترتیب معادل ۴۰۰ و ۸۰۰ و ۱۲۰۰ mosm/kg water خواهد بود. (دو رقم اعشار وزن مخصوص را در عدد ۴۰ ضرب کنید تا حدود اسمولالیتی مشخص گردد).

اسمولالیتی(اسمولاریته) ادرار

اسمولاریته ادرار در یک شخص سالم با غذای نرمال mosm/kg850-500 می‌باشد. کلیه توانایی دارد که ادراری با اسمولالیتی ۸۰-۴۰ در پرنوشی و ۱۴۰۰-۸۰۰ میلی اسمول در بی‌آبی تولید کند. در نارسایی پیشرفته کلیه ممکن است اسمولالیتی ادرار به ۲۸۵ برسد که شبیه اسمولالیتی فیلترای پلاسما توسط گلومرول بوده و بازتابی از ناتوانی کلیه برای رقیق سازی و غلیظ سازی ادرار است. در این موارد وزن مخصوص ادرار حدود ۱/۰۱۰ می‌گردد که به آن ایزوستنوری (isosthenuria) گفته می‌شود که در یک زمینه نارسایی کلیه مطرح کننده آسیب شدید به سلول‌های توبولار نفرون‌هاست.

وزن مخصوص آب مقطر یک است و یک شخص سالم با نوشیدن مایعات به اندازه کافی، ادراری با وزن مخصوص ۱/۰۲۲ – ۱/۰۱۶در ۲۴ ساعت تولید می‌کند. بهرحال کلیه این توانایی را دارد که وزن مخصوص ادرار را در گستره ۱/۰۳۵ – ۱/۰۰۳ در پرنوشی و بی‌آبی تنظیم کند. چنانچه یک نمونه راندوم ادرار دارای وزن مخصوص ۱/۰۲۳ یا بالاتر باشد می‌توان نتیجه گرفت که قدرت غلیظ سازی کلیه خوب است. چنانچه وزن مخصوص ادرار به کمتر از ۱/۰۰۷ افت کند اصطلاح هایپوستنیوری (Hyposthenuria) بکار می‌رود. گاهی وزن مخصوص ادرار در افراد مبتلا به دیابت بی‌مزه به ۱/۰۰۱ یعنی نزدیک به آب می‌شود. دفع ادرار با وزن مخصوص کم در طولانی مدت در اختلالاتی مانند پایلونفریت (pyelonephritis)، گلومرلونفریت و آنمی داسی شکل مشاهده می‌گردد، در حالی که ادرار غلیظ در بی‌آبی، کم کاری غده فوق کلیه، بیماری‌های کبدی و نارسایی احتقانی قلب مشاهده می‌شود. پلی‌اوری (حجم بیشتر از ۲/۵ لیتر ادرار در روز) با کاهش وزن مخصوص بیانگر دفع آب (water diuresis) و با وزن مخصوص بالا یا نرمال مطرح کننده دفع املاح همراه با آب (salt diuresis) از قبیل دیابت ملیتوس می‌باشد.

 

وزن مخصوص ادرار به شیوه‌های زیر مورد سنجش قرار می‌گیرد:

• یورینومتر یا هیدرومتر (Urinometer)
• رفراکتومتر (Refractometer)
• نوار ادراری (Reagent strip)
• نوسان فرکانس امواج صوتی (Harmonic oscillation densitometer)
• روش سقوط قطره (Falling drop method)

یورینومتر لوله‌ای با وزنه شناور است که برحسب وزن مخصوص کالیبره شده است و چنانچه در آب مقطر قرار گیرد وزن آن مقداری از آب را جابجا می‌کند به طوری که درجه بندی آن در سطح، عدد یک را نشان می‌دهد.

مواد محلول در آب موجب می‌شود که وزنه شناور یورینومتر مقدار کمتری از آب را نسبت به آب مقطر جابجا کند و در سطحی که غوطه‌ور می‌شود ترازبندی آن وزن مخصوص را نشان می‌دهد. این روش نسبت به روش‌های دیگر حساس نیست و نیاز به ۱۵-۱۰ سی‌سی ادرار دارد. قرائت یورینومتر بایستی برای درجه حرارتی که کالیبراسیون آن توسط آب مقطر انجام گرفته و معمولاً ۲۰ درجه است تصحیح گردد. بدین مفهوم که چنانچه نمونه سرد باشد بایستی مقدار ۰/۰۰۱ واحد به ازای هر ۳ درجه از دمای کالیبراسیون یورینومتر که روی آن قید شده است از وزن مخصوص کسر گردیده و به ازای هر ۳ درجه بالای دمای کالیبراسیون ۰/۰۰۱ واحد به وزن مخصوص اضافه شود. چنانچه ادرار در درمای اتاق باشد نیازی به تصحیح حرارتی ندارد. گلوکز و پروتئین مواد سنگینی هستند که وزن مخصوص را بالا برده و ربطی به قدرت غلیظ کردن کلیه ندارند و از این رو به ازای هر گرم گلوکز در دسی‌لیتر ادرار مقدار ۰/۰۰۴ و به ازای هر گرم پروتئین در دسی‌لیتر ادرار ۰/۰۰۳ بایستی از وزن مخصوص کسر گردد.

یورینومتر لوله‌ای با وزنه شناور

 

 

رفراکتومتر

رفراکتومتر بر پایه مقایسه اندکس انکسار نور (Refractive index) در هوا با اندکس انکسار نور در ادرار، بازتابی از مواد حل شده در آن را ارائه می‌دهد.

گفتنی است که  زاویه عبور نور تابشی از یک محلول تحت اثر غلظت املاح و مواد حل شده در آن قرار می‌گیرد. یک قطره ادرار به طور یکنواخت در سطح منشور رفراکتومتر پخش می‌شود. غلظت املاح ادراری تعیین کننده زاویه‌ای هستند که دسته‌ی امواج نور (day light) وارد منشور می‌کنند و صفحه نمایش وزن مخصوص بر حسب زوایای مختلف در ارتباط با وزن مخصوص کالیبره شده است. رفراکتومتر تصحیح حرارتی لازم ندارد (جبران شده در حرارت‌های ۱۵ تا ۳۸ درجه) ولی نیاز به تصحیح برای گلوکز و پروتئین دارد. سطح منشور در هر بار استفاده بایستی به طور کامل تمیز گردد و با آب مقطر عدد یک بخواند و در صورت لزوم می‌توان از پیچ تنظیم استفاده کرد. برای کالیبراسیون می‌توان از محلول ۵ درصد سدیم کلراید (Nacl) استفاده کرد که بایستی عدد۰/۰۰۱± ۱/۰۲۲ و با ساکارز ۹ درصد عدد ۰/۰۰۱ ± ۱/۰۳۴ را روی صفحه نمایش وزن مخصوص نشان دهد.

دانسیتومتری به روش Harmonic oscillation از این اصل بهره می‌برد که فرکانس امواج صوتی در یک محلول با توجه به دانسیته آن تغییر می‌کند. مقداری از ادرار وارد لوله U شکل شده که در یک انتها دارای مارپیچ الکتروماگنتیک برای تولید امواج و در انتهای دیگر دارای حسگر تغییرات فرکانس با عبور امواج از ادرار می‌باشد. نتایج وزن مخصوص تا ۱/۰۸۰ در دامنه خطی می‌باشد.

 

 

ارتباط بالینی

دامنه وزن مخصوص ادرار از ۱/۰۰۳ تا ۱/۰۳۵ متغیر است و بیشتر نمونه‌های اتفاقی و راندوم دارای وزن مخصوص ۱/۰۱۵تا ۱/۰۲۵ می‌باشند و هر نمونه راندوم با وزن مخصوص ۱/۰۲۳ یا بالاتر از نظر قدرت غلیظ سازی کلیه نرمال تلقی می‌شود. مقادیر بیشتر از ۱/۰۳۵ در بیماران با تزریق ماده حاجب عکسبرداری یا تزریق دکستران مشاهد می‌شود. استفاده از اسمومتری تحت اثر این مواد قرار نمی‌گیرد. نمونه‌هایی که دارای وزن مخصوص بالاتر از ترازبندی رفراکتومتر هستند را بایستی رقیق کرد؛ برای مثال اگر ادرار با رقت ۱:۲ با عدد ۱/۰۲۵ قرائت شود وزن مخصوص آن ۱/۰۵۰ خواهد بود. از دستگاه رفراکتومتر بایستی تنها برای سنجش وزن مخصوص ادرار استفاده کرد.

یک مثال

یک نمونه ادرار با پروتئین ۱gr/dl و قند ۱gr/dl دارای وزن مخصوص ۱/۰۳۰ است. مقدار تصحیح شده وزن مخصوص را حساب کنید.

۱٫۰۳۰ – ۰٫۰۰۳ (protein) – ۰٫۰۰۴ (glucose) = 1.023

سنجش وزن مخصوص با نوار ادراری

نوار ادرار بر مبنای تغییرات pKa یک پلی الکترولیت وزن مخصوص ادرار را مورد سنجش قرار می‌دهد؛ بدین مفهوم که اندیکاتور pH با توجه به غلظت یونی تغییر رنگ می‌دهد. سنجش وزن مخصوص با نوار چندان تحت اثر مواد سنگین از قبیل مواد حاجب عکسبرداری، قند و پروتئین قرار نمی‌گیرد.

واکنش نوار ادرار بر مبنای تغییرات PKa (ثابت تجزیه dissociation constant) یک پلی الکترولیت در محیط قلیایی است. بدین مفهوم که پلی الکترولیت در تماس با ادرار یونیزه شده و با توجه به یون‌های موجود در ادرار یون‌های هیدورژن خود را در قطعه نمایش وزن مخصوص آزاد می‌سازد که منجر به کاهش pH در قطعه نمایش و تغییر رنگ اندیکاتور می‌گردد. اندیکاتور بروم تیمول بلو (brom thymol blue) در محیط قلیایی با وزن مخصوص ۱٫۰۰ از رنگ آبی تا سایه‌های سبز تا زرد با وزن مخصوص ۱/۰۳۰ در محیط اسیدی قطعه نمایش تغییر رنگ می‌دهد. عوامل مداخله‌گر، نمونه ادرار با pH بالای ۶/۵ است که بایستی ۰/۰۰۵واحد به وزن مخصوص اضافه شود.

 

 

اساس اندازه‌گیری اسمولالیتی بر مبنای سرکوب به نقطه انجماد صورت می‌گیرد؛ بدین مفهوم که یک محلول با تراکم یونی یک اسمول یا ۱۰۰۰ میلی اسمول نقطه انجماد را ۱/۸۶ درجه سانتیگراد کمتر از نقطه انجماد آب (صفر درجه) پایین می‌آورد، از این رو افزایش اسمولالیتی موجب پایین آوردن بیشتر نقطه انجماد می‌شود.

خون در ادرار

قطعه نمایشگر خون در ادرار از خاصیت آنزیمی شبه پروکسیداز گروه هیم(Heme)  استفاده کرده و با گلبول‌های قرمز سالم و هموگلوبین اوری و میوگلوبین اوری واکنش مثبت می‌دهد. حضور ۵ یا بیشتر گلبول قرمز در هر میکرولیتر ادرار حائز اهمیت بالینی است.

 

هموگلوبین پروکسیداز

H₂o + کروماژن رنگی اکسید شده            (chromagen) کروماژن+ H₂O₂

مثبت شدن قطعه نمایشگر خون نیاز به ارتباط با یافته‌های میکروسکوپی ادرار دارد. آیا در رسوب ادرار گلبول قرمز وجود دارد؟ آیا تعداد گلبول‌های قرمز با شدت رنگ نوار هماهنگی دارد؟ آیا کست گلبول قرمز یا کست هموگلوبین وجود دارد؟ آیا گلبول قرمز تهی از هموگلوبین به صورت حلقه (ghost cell) حضور دارد؟

مشاهده گلبول قرمز در ادرار را هماچوری گویند. گفتنی است که در ادرار قلیایی و ادرار با وزن مخصوص کمتر ۱/۰۱۰ گلبول‌های قرمز لیز شده و هموگلوبین را رها می‌سازند. گاهی امتحان میکروسکوپی ادرار در این حالت گلبول‌های قرمز را به صورت حلقه‌های خالی شده از هموگلوبین نشان می‌دهد. وجود هموگلوبین آزاد در ادرار را هموگلوبین‌اوری گویند که در این حالت نوار ادرار مثبت شده ولی امتحان میکروسکوپی ادرار فاقد گلبول قرمز است. افتراق این دو حالت مهم است زیرا هموگلوبین‌اوری ناشی از همولیز داخل عروقی است و ربطی به بیماری کلیه ندارد، در حالی که طیف وسیعی از بیماری‌های کلیه با هماچوری همراهی دارند. چنانچه گلبول‌های قرمز در پ‌هاش قلیایی یا به علت وزن مخصوص کم لیز شوند شبیه به هموگلوبینوری می‌گردند. هموگلوبین‌اوری ممکن است با هموسیدرین‌اوری همراهی داشته باشد.

حضور mg50 از هموگلوبین آزاد در دسی‌لیتر به پلاسما رنگ صورتی می‌دهد. میوگلوبین در آسیب ماهیچه‌ای به خون رها شده و به علت وزن مولکولی کم (۱۷۰۰۰ دالتون) بسرعت از کلیه به صورت پیگمان‌های قرمز قهوه‌ای دفع می‌شود، در حالی که پلاسما به علت دفع سریع میوگلوبین شفاف است. هموگلوبین و میوگلوبین به صورت یکنواخت قطعه نمایشگر را رنگی می‌‌کنند در حالی که گلبول قرمز در برخورد با نوار لیز شده و واکنش به صورت نقطه‌های رنگی ظاهر می‌شود.

همولیز ممکن است با رنگی شدن پلاسما و ادرار همراه باشد. آزمایش سرم در میوگلوبین‌اوری افزایش آنزیم‌های ماهیچه‌ای مانند کراتین کیناز (CK) و آلدولاز را نشان داده و سطح هاپتوگلوبین پلاسما برخلاف هموگلوبین‌اوری که کاهش شدید دارد نرمال است.

موارد مثبت کاذب: آلودگی با اکسیدانت‌های قوی مانند هیپوکلریت که در تمیز کردن ظروف از آن استفاده می‌شود قطعه نمایشگر خون را مثبت می‌کند. آلودگی نوار ادراری یا ادرار به بتادین (آیودین) آزمایش را مثبت می‌کند. پروکسیدازهای گیاهی و آلودگی با میکروب‌های پروکسیداز مثبت مانند ای‌کلی (E.Coli) پاسخ کاذب را بدنبال دارد.

وزن مخصوص بالا موجب کاهش حساسیت نوار می‌گردد، زیرا در این حالت گلبول‌های قرمز در برخورد با نوار بسختی لیز می‌شوند. گلبول‌های قرمز در لوله آزمایش رسوب می‌کنند و از این رو مخلوط کردن ادرار قبل از نوار زدن اساسی است. فرمالین، کاپتوپریل و افزایش نیتریت حساسیت نوار را کاهش می‌دهد.

حساسیت نوار به نمایش خون با افزایش وزن مخصوص ادرار کاهش پیدا می‌کند. ویتامین C در مقدار زیاد با جلوگیری از واکنش نوار موجب منفی کاذب می‌شود.

 

آزمایش کیفی برای میوگلوبین‌اوری:

• نمونه ادرار تازه بیمار را برای رنگ بررسی کنید. میوگلوبین در ادرار تازه قرمز رنگ و با مانده شدن ادرار قهوه‌ای می‌شود. میوگلوبین در PH اسیدی پایداری کمی دارد و از این رو PH نمونه ادرار را با اضافه کردن سود خنثی کرده و در یخچال نگهداری می‌کنند. یک میلی‌لیتر ادرار را با ۳ میلی‌لیتر از محلول ۳% سولفوسالیسیلیک اسید مخلوط کنید. مشاهده رسوب رنگی بیانگر حضور پروتئین در ادرار بوده و مربوط به داروهای رنگی نمی‌باشد. گرما و اسید استیک نمی‌توانند میوگلوبین یا هموگلوبین را رسوب دهند.
• به ۵ میلی‌لیتر ادرار، ۲/۸ گرم سولفات آمونیوم افزوده و آن را مخلوط کنید، در این حالت ادرار ۸۰% از سولفات آمونیوم اشباع شده و این درجه از اشباع برای رسوب هموگلوبین ایده‌آل است. ادرار را صاف کرده چنانچه محلول صاف شده رنگی باشد ادرار دارای میوگلوبین است ولی اگر رنگی نباشد می‌تواند مربوط به هموگلوبین باشد.

 

آزمایش‌های غیر مستقیم عفونت مجاری ادراری ( آزمایش‌های نیتریت و استراز لکوسیتی)

آزمایش‌های نیتریت و استراز لکوسیتی دو آزمایش غربالگری برای عفونت دستگاه ادراری هستند. بیشتر پاتوژن‌های دستگاه ادراری هنگامی که به میزان چشمگیر (بین ۱۰^۵ تا ۱۰^۶ در هر سی‌سی) در ادرار باشند قادر به احیای نیترات به نیتریت هستند.

در میان ارگانیزم‌های احیا کننده‌ی نیترات می‌توان به ای‌کلی، کلبسیلا، انتروباکتر، پروتئوس، استافیلوکوک و سودوموناس اشاره کرد. انتروکوک قادر به احیای نیترات نمی‌باشد. با توجه به اینکه تبدیل نیترات به نیتریت به ۴ ساعت انکوباسیون ادرار در مثانه جهت عملکرد باکتری احتیاج دارد، از این رو ادرار صبح ناشتا نمونه مناسب جهت آزمایش نیتریت است. قطعه نمایشگر نیتریت آغشته به یک آمین معطره مانند پارا آرسانیلیک اسید (p. arsanilic) و کوئینولون (Quinolone) است که با نیتریت ادراری در pH اسیدی ایجاد رنگ صورتی می‌کنند.

هر مقدار از تولید رنگ یکنواخت بیانگر باکتریوری چشمگیر بوده و مثبت شدن قطعه‌ی نمایش به صورت نقطه‌ای یا لبه‌های صورتی به عنوان نتیجه مثبت تلقی نمی‌شود.

مانده شدن ادرار در محیط آزمایشگاه به علت رشد آلوده کننده‌ها و داروهایی که ادرار را به رنگ قرمز در می‌آورند و یا در محیط اسیدی قرمز می‌شوند مانند فنازوپیریدین در قطعه نمایشگر ایجاد رنگ کرده و تفسیر را مشکل می‌سازند.

افزایش وزن مخصوص ادرار، میزان بالای اسکوربیک اسید، یوروبیلینوژن و پ‌هاش کمتر از ۶ موجب کاهش حساسیت نوار به شناسایی نیتریت می‌گردد.

کاهش نیترات در غذا و آب مصرفی تست نیتریت را حتی با تراکم زیاد میکروب منفی می‌کند. نمونه ادرار اتفاقی به علت کاهش زمان انکوباسیون ادرار در مثانه نتیجه را منفی کاذب می‌کند.

گفتنی است که در برخی موارد میکروب قادر به احیای نیترات به نیتریت بوده ولی نیتریت تولید شده را به ترکیبات دیگری مانند نیتروژن، اکسید نیتریک و آمونیاک تبدیل می‌کند و از این رو نبایستی با منفی شدن نیتریت باکتریوری را کنار گذاشت.

 

آزمایش نیتریت

تست نیتریت آزمایشی سریع و روشی غیر مستقیم برای تشخیص باکتریوری چشمگیر (>10⁵ / ml) می‌باشد. نیترات موجود در آب و مواد خوراکی توسط آنزیم میکروب‌ها به ویژه میکروب‌های خانواده کلی‌فرم (coliform) از قبیل ای‌کلی، ‌انتروباکتر، سیتروباکتر، کلبسیلا و پروتئوس به نیتریت تبدیل می‌شود.

برای احیای نیترات به نیتریت به ۴ ساعت انکوباسیون ادرار در مثانه نیاز است و از این رو نمونه ادرار مناسب برای آزمایش نیتریت، ادرار اول صبح است. قطعه نمایشگر نیتریت روی نوار ادرار با واکنش زیر نیتریت را تشخیص می‌دهد:

Nitrite + P. arsanilic acid à diazonium compound

رنگ صورتی Diazonium compound + Quinoline à

نکته: رنگ صورتی به صورت منتشره و یکنواخت به هر مقدار دارای ارزش و معادل >10⁵ میکروب در هر سی‌سی ادرار است. چنانچه کناره‌های قطعه نمایشگر صورتی شود و یا رنگ صورتی به صورت نقطه‌ای در آید فاقد ارزش است.

برای تست نیتریت ادرار بایستی تازه باشد، چون تکثیر میکروب‌های آلوده کننده ممکن است موجب مثبت کاذب شود. تفســیر نیتـریت در ادرار قـرمــز رنگ و یا ادراری که حـــاوی داروی فنازوپیریدین (phenazo pyridine) است مشکل می‌شود.

حساسیت آزمایش نیتریت در ادرار با وزن مخصوص بالا و یا افزایش سطح ویتامین C کم می‌شود. آزمایش منفی نیتریت را نبایستی به عنوان آزمایش کنار گذاشتن عفونت ادراری مطرح کرد زیرا:

• ممکن است میکروب‌های ادراری قابل به تولید نیتریت نباشند.
• ادرار ممکن است زمان لازم در مثانه نمانده باشد.
• ممکن است بیمار مواد نیترات‌دار مصرف نکرده باشد.
• ممکن است نیتریت به نیتروژن تبدیل شده باشد.

مثبت شدن واقعی نیتریت اغلب با نمایش مثبت استراز لکوسیتی همراه است.

 

 

 

لکوسیت‌های ادرار (لکوسیت استراز)

نوتروفیل از لکوسیت‌های شایع دستگاه ادراری است. مقدار نرمال آن کمتر از ۵ عدد در هر میدان با درشت‌نمایی ۴۰ (HPF) است. افزایش بیشتر از مقدار طبیعی را پیوری( pyuria) گویند.

گفتنی است که در ادرار با وزن مخصوص پائین یا هیپوتونیک و نیز ادرار قلیایی حدود ۵۰% از گلبول‌های سفید در ۳-۲ ساعت پس از مانده شدن ادرار در حرارت اتاق از بین می‌روند و در این گونه موارد تست لکوسیت استراز نوار ادراری دارای ارزش است و مثبت شدن آن بیانگر پیوری در ادرار هیپوتونیک است، در حالی که در زیر میکروسکوپ ممکن است تعداد اندکی گلبول سفید باقی مانده باشند.

سیتوپلاسم نوتروفیل‌ها در ادرار رقیق (هیپوتونیک) متورم شده و گرانول‌های سیتوپلاسمی آن براق و دارای حرکت براونی (Brownian) می‌گردند که در این حالت به آنها سلول‌های درخشان یا سلول گلیتر(glitter) گفته می‌شود و زمانی تصور می‌شد که ارزش تشخیصی برای پیلونفریت دارند.

 

 

استراز لکوسیتی

گلبول‌های سفید به صورت آزاد و کلامپ یا خوشه‌ای در رسوب ادرار دیده می‌شوند. شکل خوشه‌ای نشانه فعال بودن عفونت یا التهاب است. چسبیدن گلبول سفید به یکدیگر از طریق اگزودای فیبرینی صورت می‌گیرد. برای گزارش گلبول‌های سفید حداقل ۱۰ میدان HPF برای گلبول سفید آزاد و خوشه‌ای (کلامپ) شمرده و میانگین آنها در هر میدان گزارش می‌گردد.

برای مثال ممکن است به طور میانگین در هر میدان ۱۲-۱۰ عدد گلبول سفید آزاد و ۲-۱ کلامپ یا خوشه گلبول‌های سفید دیده شود.

چنانچه بیماری پیوری چشمگیر مثلاً بیش از ۳۰ عدد گلبول سفید دارد ولی کشت ادرار مرتب منفی می‌شود (پیوری استریل) بایستی به عفونت‌های غیرهوازی، سل و یا التهاب فکر کرد. تعداد گلبول‌های سفید در تب و ورزش سنگین به طور موقت در ادرار افزایش می‌یابند. نوتروفیل‌های سالم و دژنره شده را در ادرار می‌توان با خاصیت استراز نوتروفیلی تشخیص داد.

رنگ ارغونی Indoxyl carbocic acid ester + esterase  → indoxyl + diazonium salt   à

در واکنش فوق بجای ترکیبات ایندوکسیل می‌توان از ترکیب استری پیرول استفاده کرد. پیرول آزاد شده با نمک دیازونیوم ایجاد رنگ ارغوانی می‌کند. گرانولوسیت‌ها و منوسیت‌ها حاوی استراز می‌باشند. نتیجه آزمایش در ۲ دقیقه قرائت می‌شود. حساسیت نوارهای Multistix و Chemstrip به ترتیب ۵ تا ۱۵ و ۱۰ تا ۲۵ گلبول سفید در میدان HPF می‌باشد.

مثبت کاذب

• باقی ماندن اکسید کننده‌های قوی که در شستشوی ظروف بکار رفته است.
• نگهدارنده فرمالین
• حضور نیترفورانتوئین در ادرار موجب تفسیر اشتباهی تست می‌شود.
• داروهایی که دارای Imipenem و Meropenem و ‍Clavulanic acid می‌باشند.
• انگل تریکوموناس حاوی آنزیم استراز است.

منفی کاذب

• وزن مخصوص بالای ادرار، غلظت زیاد گلوکز (>3gr/dl) و پروتئین ادرار(>500mg/dl) و نیز غلظت زیاد اسکوربیک اسید، رعایت نکردن زمان دو دقیقه‌ای در قرائت تست، منفی کاذب می‌دهند و گفتنی است که تولید رنگ استراز لکوسیت به بیشترین زمان (دو دقیقه) در میان سایر پارامترهای ادراری نیاز دارد. اگزالیک اسید، سفالکسین، سفالوتین، جنتامایسین و تتراسیکلین موجب کاهش حساسیت نوار می‌گردد.

PH ادرار

کلیه در همراهی با ریه تنظیم کننده‌های اصلی تعادل اسید و باز هستند. کلیه رل تنظیمی خود را با ترشح یون هیدروژن به اشکال یون آمونیوم، هیدروژن فسفات و اسیدهای آلی ضعیف و با بازجذب بیکربنات انجام می‌دهد. اولین ادرار صبحگاهی در یک شخص سالم اندکی اسیدی و دارای پ‌هاش ۵ تا ۶ است. بعد از خوردن غذا پ‌هاش ادرار قلیایی‌تر می‌شود (alkaline tide). پ‌هاش یک نمونه راندوم ادرار در یک شخص سالم از ۴/۵ تا ۸ می‌تواند متغیر باشد و همیشه بایستی پارامتر PH را در رابطه با وضعیت اسید و باز عملکرد کلیه، رژیم غذایی، داروها،‌ عفونت‌های ادراری،‌ مانده شدن نمونه ادرار و … تفسیر کرد.

برای مثال انتظار می‌رود که pH ادرار در اسیدوز متابولیک یا اسیدوز تنفسی اسیدی باشد و یا بالعکس در الکالوز متابولیک یا الکالوز تنفسی قلیایی شود.

حال چنانچه pH ادرار در مطابقت با وضعیت بیمار نبود ممکن است بیانگر اختلال کلیوی در ترشح یا جذب اسید و باز باشد. سنجش pH ادرار در شناخت کریستال‌ها و جلوگیری از تشکیل سنگ‌های ادراری مهم است. برای مثال اگزالات کلسیم و اسید اوریک در pH اسیدی ایجاد سنگ می‌کنند و قلیایی کردن ادرار کمک به حل کردن و جلوگیری از تشکیل اینگونه سنگ‌ها می‌کند.

مثال دیگر اینکه عفونت‌های مجاری ادرار با میکروب‌هایی که اوره را تجزیه می‌کنند(Urease positive)  تولید پ‌هاش قلیایی می‌کنند و اسیدی کردن ادرار کمک به درمان عفونت می‌کند، چون در محیط اسیدی میکروب‌های اوره‌آز مثبت (positive urease) قادر به تکثیر نیستند.

ادرار مانده بدون نگهدارنده، دارای پ‌هاش قلیایی توسط ارگانیزم‌های اوره‌آز مثبت می‌شود. رژیم غذایی در کنترل پ‌هاش نقش مهمی دارد؛ برای مثال غذاهای سرشار از پروتئین و گوشت ادرار را اسیدی و غذاهای گیاهی و سبزیجات و میوه با تولید سیترات و بیکربنات که از متابولیت‌های آن است، ادرار را قلیایی می‌کنند. پ‌هاش ادرار در افراد سالم و یا شرایط غیرطبیعی به مرز ۹ نمی‌رسد و این حالت بیانگر نمونه بسیار مانده و نامناسب است و نیاز به نمونه جدید و تازه برای آنالیز دارد. سنجش pH با نوار ادراری chemistrip) و(multistix  پ‌هاش را در محدوه ۵ تا ۹ با حساسیت ۰/۵ تا یک واحد نشان می‌دهد. کمپانی سازنده برای افتراق pH در این طیف وسیع از دو سیستم اندیکاتور متیل قرمز (methyl Red) و بروم تیمول آبی (bromthymol blue) استفاده می‌کند. اندیکاتور methyl red در محدوده پ‌هاش ۴ تا ۶ از رنگ قرمز به زرد و بروم تیمول آبی در محدوده ۶ تا ۹ از رنگ زرد تا آبی در می‌آید.

در قطعه نمایش pH در طیف pH بین ۵ تا ۹ می‌توان شاهد رنگ نارنجی در پ‌هاش ۵ تا زرد و سبز و سپس تا آبی سیر در پ‌هاش ۹ بود.

مهم‌ترین نکته در اندازه‌گیری پ‌هاش جلوگـــیری از سرریــز شدن قطعه نمایشگر و ایجاد پل ادراری (Run over) بین قطعه نمایش pH و پروتئین است. قطعه نمایش پروتئین دارای بافر اسیدی قوی بوده که با نفوذ به قطعه pH می‌تواند pH قلیایی ادرار را به اشتباه اسیدی کند.

 

پروتئین ادرار

در میان آزمایش‌های بیوشیمی ادرار تشخیص پروتئینوری برای بیماران کلیوی بسیار حائز اهمیت است. ادرار نرمال دارای مقدار اندکی پروتئین کمتر از ۱۰mg/dl یا ۱۰۰mg در ادرار ۲۴ ساعته است و به طور عمده از پروتئین‌های با وزن مولکولی کم و ترشحات پروتئینی تام هورسفال است.

پروتئینوری بیشتر یا مساوی (۳۰۰ mg/l) 30mg/dl حائز اهمیت بالینی بوده و در سه دسته پره‌رنال (pre renal)،‌ کلیوی (Renal) و بعد از کلیه (post renal) جای می‌گیرد.

هموگلوبینوری و میوگلوبینوری و دفع پروتئین بنس‌ جونز از مثال‌های پره‌رنال، است؛ بدین مفهوم که افزایش ورود(over flow)  به گلومرول و فیلتر شدن و اشباع شدن سیستم بازجذب موجب پروتئینوری‌ می‌شود و در ابتدا بیماری کلیوی مطرح نبوده است. البته دفع پروتئین‌های فوق به طور مزمن برای کلیه نفروتوکسیک بوده و ممکن است به نارسایی کلیه ختم شود.

با توجه به اینکه نوار ادراری به سنجش آلبومین حساس است از این رو پروتئینوری پره‌رنال در تجزیه ادرار روزمره ممکن است مشخص نشود.

پروتئینوری با منشأ کلیه ممکن است منبع گلومرولار یا توبولار داشته باشد. بیماری‌های گلومرولار ممکن است با پروتئینوری خفیف (کمتر از یک گرم در روز) تا متوسط (بین یک تا ۴ گرم در روز) و شدید (بیشتر از ۳ تا ۴ گرم در روز) همراه باشد. آسیب به گلومرول و کاهش شارژ منفی غشای پایه موجب پروتئینوری می‌شود.

بیماری التهابی آتوایمون مانند لوپوس، گلومرولونفریت ناشی از رسوب کمپلکس‌های ایمنی و متعاقب عفونت با استرپ گروه A از مثال‌های پروتئینوری گلومرولار هستند.

پروتئینوری در ابتدای بیماری ممکن است انتخابی (Selective) و در موارد پیشرفته غیر انتخابی باشد و پروتئین‌های با وزن مولکولی زیاد نیز وارد ادرار شوند.

پرفشاری خون منجر به افزایش فشار گلومرول و فیلتر شدن آلبومین بیشتر می‌شود. ورزش سنگین با افزایش فشار گلومرولی موجب پروتئینوری اندک و موقتی می‌گردد. پروتئینوری همراه با افزایش فشار خون در خانم حامله حائز اهمیت بالینی بوده و مواردی مانند پره اکلامپسی را ممکن است مطرح کند.

پروتئینوری توبولار

پروتئین‌های با وزن مولکولی کم مانند لیزوزیم‌ها و _۲β میکروگلوبولین براحتی از گلومرول فیلتر شده و توسط سلول‌های توبولی کلیه بازجذب می‌شوند. حال اگر توبول‌های کلیه بیمار باشند بازجذب این پروتئین‌ها صورت نگرفته و در ادرار ظاهر می‌شوند که به آن پروتئینوری توبولار گفته می‌شود. برای مثال دفع بیشتر از ۱۰۰ میکروگرم _۲β میکروگلوبولین در روز بیانگر پروتئینوری توبولار است. پروتئینوری توبولار در مواردی از قبیل سندرم فانکونی، سیستینوز، بیماری ویلسون، پیلونفریت و رد پیوند کلیه و مسمومیت با فلزات سنگین مشاهده شده است و مقدار دفع آن حدود یک تا دو گرم در روز است.

گرچه آلبومینوری در پروتئینوری توبولار دیده می‌شود ولی مراحل اولیه بیماری ممکن است با نوار ادرار که حساس به سنجش آلبومین است تشخیص داده نشود.

 

پروتئینوری وضعیتی یا ارتوستاتیک (postural)

اینگونه پروتئینوری احتمالاً خوش‌خیم و در ارتباط با وضعیت ایستاده است. گمان می‌رود که افزایش فشار روی ورید کلیه در وضعیت عمودی موجب پروتئینوری گردد. در این موارد شخص مبتلا با مثانه خالی خوابیده و یک نمونه ادرار پس از برخاستن از خواب و نمونه دیگر پس از چند ساعت (حدود ۲ ساعت) در وضعیت ایستاده و پیاده‌‌روی گرفته می‌شود. منفی شدن پروتئین در نمونه صبحگاهی و مثبت شدن پس از ایستادن و پیاده‌‌روی تشخیص را قطعی می‌کند. پروتئینوری در این موارد کمتراز یک گرم در روز بوده و گفتنی است که این حالت پروتئینوری در ۳ تا ۵% جوانان و بالغین سالم ممکن است مشاهد شود.

میکروآلبومینوری

نفروپاتی یا نارسایی تدریجی کلیه ناشی از دیابت تایپ ۱ و ۲ یکی از عوارض دیابت است. گفتنی است که شروع آسیب کلیوی در دیابت با مثبت شدن میکروآلبومینوری آغاز می‌گردد و در این مرحله ممکن است بتوان با کنترل قند خون و کنترل فشار خون از پیشرفت بیماری کلیه جلوگیری کرد.

با روش‌های قدیمی دفع ۳۰ تا ۳۰۰ میلی‌گرم آلبومین در ادرار ۲۴ ساعته یا دفع ۲۰ تا ۲۰۰ میکروگرم در دقیقه (µg/min) به عنوان میکروآلبومینوری تلقی می‌شود.

نکته: ورود پروتئین به ادرار ممکن است منبعی بعد از کلیه(Post Renal)  داشته باشد؛ برای مثال آلوده شدن ادرار به خون در سیکل ماهانه یا آسیب مثانه در نتیجه سنگ کلیه و یا اگزودای میکروبی که ممکن است با مثبت شدن پروتئین در ادرار جلوه کند.

 

قطعه نمایشگر پروتئین

سنــــــــــجش پروتئین ادرار بر مبنای خطای اندیکاتور pH در حضور پروتـــــــــــئین است! (Protein error of Ph indicator).

این به مفهوم آنست که نقطه تغییر pH بعضی از اندیکاتــــــــــــــــــورها مانند تترابروم فنل بلو (Tetra bromphenol) در حضور یا فقدان پروتئین متفاوت است. پروتئین‌ها به عنوان گیرنده هیدورژن در یک pH ثابت عمل می‌کنند. اندیکاتور در pH بین ۳ و ۴ از رنگ زرد به رنگ آبی یا سبز در می‌آید ولی در حضور پروتئین این تغییر رنگ در pH بین ۲ و ۳ رخ می‌دهد و از این رو در حضور پروتئین یک خطا در عملکرد این اندیکاتور مشاهده می‌شود. به معرف قطعه نمایشگر پروتئین یک بافر اسیدی افزوده شده که pH=3 را روی قطعه ثابت نگه می‌دارد. در غیاب پروتئین این قطعه زرد و تولید رنگ سبز یا آبی به هر اندازه گویای حضور پروتئین در ادرار است. تولید رنگ به ۶۰ ثانیه زمان نیاز دارد. قطعه نمایشگر به واکنش اندک (Trace) بسیار حساس بوده و از این رو ادرار غلیظ ایجاد و اکنش اندک برای پروتئین می‌کند. نوار ادرار بسیار حساس به سنجش آلبومین است و به پروتئین‌های دیگر ادراری از قبیل گاماگلوبولین، گلیکوپروتئین‌ها، آنزیم‌ها، هموگلوبین، پروتئین تام هورسفال و پروتئین بنس جونز حساس نمی‌باشد و از این رو منفی شدن نوار برای پروتئین برای کنار گذاشتن پروتئینوری کفایت نمی‌کند. پاسخ کاذب پروتئین در ادرار قلیایی و ادرار مانده مشاهد می‌شود. پ‌هاش قلیایی با فائق شدن بر pH بافر اسیدی نوار موجب تغییر رنگ‌ آن می‌شود. چنانچه نوار برای مدت طولانی در ادرار غوطه‌ور شود موجب شسته شدن بافر اسیدی و تغییر رنگ آن به آبی حتی در غیاب پروتئین می‌شود. ترکیبات (Quaternary ammonium) که در تمیز کردن ظروف بکار می‌رود موجب تغییر pH و پاسخ مثبت کاذب می‌شود. آلوده شدن نوار به کلرهگزیدین که به عنوان ضدعفونی کننده پوست بکار می‌رود نیز موجب پاسخ مثبت کاذب می‌شود. حرارت موجب دناتوره شدن و رسوب اکثر پروتئین‌ها شده اما هموگلوبین و میوگلوبین با این روش رسوب نمی‌کنند.

 

روش کار:

حدود ۱۰ میلی‌لیتر ادرار صاف یا سانتریفوژ شده را در لوله پیرکس ریخته و قسمت بالای لوله را روی شعله گرفته و حرارت دهید، چنانچه کدورتی ایجاد گردید ممکن است به واسطه حضور پروتئین‌ها و یا فسفات‌ها و کربنات‌ها باشد. برای رفع ابهام ۳ تا ۵ قطره محلول ۵ تا ۱۰ درصد اسید استیک اضافه کرده و دوباره حرارت داده می‌شود. در PH اسیدی املاح فسفات و کربنات محلول گردیده و محیط اسیدی رسوب پروتئین‌ها را تشدید می‌کند.

برای اندازه‌گیری پروتئین‌ها می‌توان رسوب ناشی از TCA (تری کلرواستیک اسید) را در محلول هیدروکسید سدیم حل کرده و سپس با روش بیوره اندازه گرفت. هر چند برخی از پروتئین‌ها با درجه متفاوتی با اسیدهای فوق واکنش می‌دهند ولی استفاده از هر کدام برای سنجش پروتئین تام (total protein) ادرار بلامانع است.

برای سنجش پروتئین ادرار می‌توان از روش اتصال رنگ مانند رنگ‌های کوماسی بلو (Coomassie blue) و یا پانچو-اس (ponceau-s) استفاده کرد. بنزیتونیوم کلراید (benzethonium Chloride) با پروتئین‌ها ایجاد کدورت و پیروگالول (Pyrogallol Red-molybdate) با پروتئین‌ها ایجاد رنگ بنفش آبی می‌کند. برای تهیه استاندارد پروتئین بایستی سرم کنترل را با محلول سرم فیزیولوژی رقیق ساخت و غلظت‌های مختلف استاندارد را با توجه به فرمول C₁V₁= C₂V₂  بدست آورد.

برای مثال برای ساختن ۱۰۰ میلی‌لیتر استاندارد با غلظت ۱۰۰ میلی‌گرم در دسی‌لیتر از سرم کنترل با غلظت پروتئین  gr/dl6 بایستی چه میزان از سرم کنترل برداشته شود؟

۶ gr/dl = 6000 mg/dl

C₁V₁= C₂V₂

۶۰۰۰ ×V₁= 100 ×۱۰۰ ml

V₁ = 1.67 ml

۱/۶۷ میلی‌لیتر از سرم کنترل ر ا برداشته و بوسیله سرم فیزیولوژی به حجم ۱۰۰ میلی‌لیتر می‌رسانیم.

 

واکنش پروتئین با نوارهای ادراری

خطای اندیکاتور pH در حضور پروتئین اساس تشخیص پروتئین ادراری است. مفهوم این عبارت چیست؟

برخلاف عقیده کلی که اندیکاتورهای pH در پ‌هاش‌های مختلف تغییر رنگ می‌دهند بایستی گفت که برخی از اندیکاتورها در حضور پروتئین تغییر رنگ می‌دهند حتی اگر pH محیط ثابت بماند. این پدیده به علت آن است که پروتئین‌ها به ویژه آلبومین می‌توانند یون هیدروژن را از اندیکاتور بپذیرند و رنگ آن را تغییر دهند. آزمایش به سنجش آلبومین حساسیت بیشتری دارد زیرا آلبومین گروه‌های آمینی بیشتری برای پذیرش یون هیدرون نسبت به پروتئین‌های دیگر دارد.

قطعه نمایشگر پروتئین در نوار ادراری با اندیکاتور تترابروم فنل بلو (tetrabromphenol) و یا تتراکلروفنول- تترابرومو سولفوفتالئین در بافر اسیدی برای ثابت نگه داشـتن pH آغشته شده است. در pH= 3 هر دو اندیکاتور در فقدان پروتئین به رنگ زرد هستند ولی با غلظت‌های مختلف پروتئین رنگ اندیکاتور با سایه‌های سبز و بالاخره تا رنگ آبی در می‌آید. پروتئین به صورت اندک (trace) تا ۴+ یا نیمه کمی به صورت ۳۰، ۱۰۰، ۳۰۰ و … mg% قرائت می‌شود. مقدار اندک (trace) کمتر از ۳۰ mg% است. همیشه وقتی غلظت پروتئین به صورت اندک است وزن مخصوص ادرار را مد نظر قرار دهید چون پروتئین اندک در ادرار غلیظ ممکن است یک یافته طبیعی ولی در ادرار رقیق حائز اهمیت باشد. لازم به یادآوری است که قلیایی بودن شدید ادرار، نگه داشتن طولانی مدت نوار در ادرار، آلودگی نوار به پاک کننده‌ها و ضد عفونی کننده‌ها و پیگمان‌های ادراری ناشی از داروی فنازوپیریدین با مثبت کاذب همراهی دارند.

آزمایش رسوب پروتئین با سولفوسالیسیلیک اسید (SSA)

سولفوسالیسیلیک اسید در هوای اتاق با تمام پروتئین‌ها واکنش رسوبی سفید رنگ می‌دهد.

آزمایش رسوبی پروتئین با SSA را بایستی روی نمونه سانتریفوژ شده انجام داد، البته هر ماده‌ای که با اسید رسوب کند موجب کدورت و مثبت کاذب می‌شود که در این میان می‌توان به مواد حاجب عکسبرداری، متابولیت‌های تال بوتامید(Tol butamide) ، سفالوسپورین‌ها، پنی‌سیلین و سولفانامیدها اشاره کرد. حضور مواد حاجب رادیوگرافی با وزن مخصوص بسیار بالا همراهی دارد. برخلاف نوار، pH قلیایی ادرار موجب منفی کاذب می‌شود و استفاده بیشتر از SSA برای اسیدی کردن محیط ممکن است جواب صحیح پروتئین را نشان دهد.

تمام پروتئین‌های ادراری را با روش سولفوسالیسیلیک اسید ۳% می‌توان مورد سنجش قرارداد. برای این منظور به ۳ سی‌سی ادرار سانتریفوژ شده در یک لوله تمیز حجم مساوی از اسید سولفوسالیسیلیک اضافه شده و پس از مخلوط کردن دقیقاً بمدت ۱۰ دقیقه نگهداری می‌شود. با پایان انکوباسیون دوباره مخلوط کرده و در نور معمولی اتاق (از لامپ روشن استفاده نشود) درجه کدورت یادداشت می‌شود.

واکنش منفی = محلول صاف

واکنش اندک (Trace): در این حالت اندکی کدورت (ابری) قابل درک است. میزان پروتئین اوری حدود mg/dl20 می‌باشد.

واکنش ۱+: کدروت واضح بدون گرانولاسیون و ذرات سفید رنگ مشاهده می‌شود. در این حالت پروتئین اوری حدود mg50 در دسی‌لیتر است.

و اکنش ۲+: کدورت واضح با گرانولاسیون و ذرات سفید رنگ مشاهده شده ولی رسوب برفی مشاهد نمی‌شود. پروتئینوری در این حالت حدود mg200 در دسی‌لیتر است.

واکنش ۳+: کدروت واضح (ابری) با رسوب ذره‌ای و برفی (granulation and flocculation) مشاهده گردیده و پروتئینوری حدود mg500 در دسی‌لیتر است.

واکنش ۴+: پروتئینوری به صورت لخته شده یا سفیده تخم مرغ پخته شده در می‌آید و پروتئینوری حدود ۱۰۰۰ میلی‌گرم در دسی‌لیتر است.

معرف اکستون (۵ درصد سولفوسالیسیلیک اسید در محلول سولفات سدیم) ایجاد رسوب یکنواخت در حضور پروتئین می‌کند. برای ساختن معرف اکستون (Exton’s) 88 گرم سولفات سدیم را در ۶۰۰ سی‌سی آب مقطر به کمک حرارت حل نموده و پس از سرد شدن به آن ۵۰ گرم سولفوسالیسیلیک اسید اضافه نموده و حجم آن به cc 1000 با آب مقطر می‌رسد.

درمان با تال بوتامید (Tolbutamide)، دوزاژ بالای پنی‌سیلین و سولفونامیدها و تا ۳ روز پس از تزریق ماده حاجب عکسبرداری، موجب پاسخ مثبت کاذب پروتئین با روش سولفوسالیسیلیک اسید می‌گردد. ادرار با pH قلیایی شدید ممکن است نتیجه منفی کاذب با سولفوسالیسیلیک اسید دهد. داروها روی نمایش پروتئین نوار ادراری اثری ندارند.

 

برای دانلود پی دی اف بر روی لینک زیر کلیک کنید