آزمایشگاه تشخیص پزشکی و قارچ‌شناسی کلینیکی
بخش چهارم
دکتر محمد قهری
www.ghahri.ir
آزمایش‌های اندازه‌گیری آنتی‌ژن‌ها و مواد متابولیکی (متابولیت‌ها)
آزمایش‌های اندازه‌گیری آنتی‌ژن‌های قارچی یا محصولات متابولیکی در سرم یا سایر مایعات بدن یک روش مستقیم برای تشخیص سرودیاگنوستیکی عفونت‌های مهاجم قارچی است. در سالیان اخیر پیشرفت‌های قابل توجهی در این زمینه انجام گردیده است، با این حال برای اکثر عفونت‌های قارچی روش قابل قبول و مورد توافقی فراهم نشده است. اگرچه در حال حاضر چندین تست برای آزمایش آنتی‌ژن‌های قارچی استاندارد شده و به‌صورت کیت‌های تجاری در دسترس قرار گرفته است، اما هنوز ملاحظات مربوط به حساسیت و اختصاصیت تست‌های مختلف در جمعیت‌های خاصی از بیماران وجود دارد؛ از جمله اینکه کدام یک از گروه‌های جمعیتی باید پایش شوند؟ آزمایش‌ها چند وقت یک‌بار باید انجام شوند؟ عملکرد تست‌ها در پروسه‌ی زمانی مربوط به پیشرفت و یا بهبودی در سیر بیماری چگونه است؟ کدام راهکار یا استراتژی‌های انجام آزمایش بیشتر عملی هستند و از هزینه – اثربخشی مناسبی برخوردارند؟ و بالاخره اینکه تأثیر حقیقی چنین تست‌هایی بر روی عاقبت (بهبودی) بیمار چیست؟
در حال حاضر بهترین و پرکاربردترین تست‌های آنتی‌ژن قارچی، تست لاتکس و تست آنزیم ایمیونواسی (EIA) برای جستجوی آنتی‌ژن پلی ساکاریدی کپسولی کریپتوکوکوس نئوفرمنس است. تست‌های تجاری‌شده و در دسترس برای آنتی‌ژن کریپتوکوکال بیش از 95% مننژیت‌های کریپتوکوکوسی و تقریباً 67% عفونت‌های منتشره‌ی کریپتوکوکوسی را شناسایی می‌کند. این تست به‌خوبی استاندارد شده، پرکاربرد است و برای تشخیص مننژیت کریپتوکوکال جایگزین آزمایش مرکب چین (که حساسیتی کمتر از 40% دارد) گردیده است.
آزمایش آنتی‌ژنیِ مفیدِ دیگری که مورد استفاده قرار می‌گیرد آزمایش برای آنتی‌ژن هیستوپلاسما است که یک آزمایش رفرانس (Mira Vista Diagnostics, Indianapolis, IN) است. آزمایش آنتی‌ژن هیستوپلاسما یک آزمایش سریع است (کمتر از 24 ساعت) و حساسیت معادل 55 الی 99 درصد و اختصاصیت بیش از 98 درصد دارد و همچنین از قابلیت تکرارپذیری خوبی برخوردار است. این آزمایش در فرمت EIA انجام می‌شود و آنتی‌ژن پلی‌ساکاریدی اختصاصی هیستوپلاسما را در مایعات بدن اندازه‌گیری می‌کند. نمونه‌های سرم و ادرار شایع‌ترین و معمول‌ترین نمونه‌های مورد آزمایش هستند. آنتی‌ژن ممکن است در مایع مغزی نخاعی 42 الی 67 درصد بیماران مبتلا به مننژیت هیستوپلاسما و در نمونه‌ی لاواژ برونکوآلوئلار 70 درصد بیماران مبتلا به ایدز و هیستوپلاسموز ریوی نشان داده شود.
مانان (Mannan) یک آنتی‌ژن در گردش و مهم در بیماران مبتلا به کاندیدیازیس تهاجمی است. اندازه‌گیری این آنتی‌ژن دارای پیچیدگی‌های خاصی است. دارای کلیرانس سریعی در سرم بوده و نیز قابلیت اتصال به آنتی‌بادی ضد مانان موجود در سرم دارد. مانان موجود در سرم را می‌توان به‌وسیله‌ی چندین روش آزمایشگاهی مورد آزمایش قرار داد که در این‌ها واپاشی(dissociation) کمپلکس‌های آنتی‌ژن– آنتی‌بادی برای بدست آوردن حساسیت مطلوب موردنیاز است. در روش EIA برای اندازه‌گیری مانان حساسیت‌های بین 25 الی 100 درصد و اختصاصیت‌های معادل 92 تا 100 درصد نشان داده شده است.
سیستم‌های تجاری‌شده‌ی اولیه برای نشان دادن مانان که از فرمت آگلوتیناسیون لاتکس استفاده می‌کردند (Pastorex Candida Test, Sanofi Diagnostics, Pasteur, Mames-la-coquette, France) حساسیت ضعیفی معادل 0 الی 25 درصد نشان می‌دادند که این حساسیت ضعیف مربوط به کلیرانس سریع مانان از سرم و فرمت غیرحساس آگلوتیناسیون لاتکس بوده است.
بعد از این آزمایش Platelia Candida Antigen (BioRad) از فرمت الایزای دوبل ساندویچ بر اساس آنتی‌بادی منوکلونال استفاده کرد که حساسیت تست افزایش یافت و نیز قادر به اندازه‌گیری مانان در محدوده‌ی 0/1 نانوگرم در یک میلی‌لیتر ســرم بود. در ارزیابـــی‌های کلینیکال انجام‌شــــده بـــــرای تســـت Platelia Candida Antigen، حساسیت بین 40 الی 86 درصد و اختصاصیت بین 79 الی 98 درصد را گزارش کرده‌اند. در واقع هر مطالعه‌ای که به ارزیابی سنجش مانانمی (Mannanemia) پرداخته است برای فائق آمدن بر کلیرانس سریع سرمی در بیماران و اپتیمایز کردن حساسیت تشخیصی تست از نمونه‌های سریال متعدد استفاده کرده‌اند. Sendid و همکارانش با در نظر گرفتن اختلافی که در کلیرانس آلفا- مانان (کلیرانس سریعی دارد) و بتا- مانان (که کلیرانس آهسته‌تری دارد) وجود دارد، نشان دادند که اندازه‌گیری همزمان هر دو فرم مانان حساسیت تست را برای مانانمی (Mannanemia) به‌منظور تشخیص کاندیدیازیس تهاجمی از 69% که با هریک از تست‌های آلفا – یا بتا- مانان به‌تنهایی بدست می‌آیند، هنگامی‌که هر دو فرم مورد آزمایش قرار می‌گیرند به 85% می‌رساند. اختصاصیت یک تست به تنهایی در مورد آلفا- مانان معادل 98 درصد و در مورد بتا- مانان به تنهایی معادل 95 درصد بوده است و هنگام بکار بردن هر دو تست به‌طور همزمان، حساسیت معادل 95 درصد بوده است. این محققین همچنین نشان دادند که مانانمی بر علائم کلینیکال و نیز جداسازی کاندیدا در کشت (که به‌طور متوسط 4/7 روز طول می‌کشد) تقدم (زمانی) دارد. اگرچه آزمایـــــــــــــــــــش Platelia Candida Antigen تنها برای آلفا– مانان اختصاصی است، نتایج بدست‌آمده مطرح‌کننده‌ی این مطلب است که اندازه‌گیری هر دو اپی‌توپ یک روش خردمندانه و منطقی است که در افزایش حساسیت تشخیصی و نیز تشخیص به‌موقع بیماری سهم دارد.
هرچند که یک تست تجاری‌شده برای اندازه‌گیری بتا- مانان هنوز در دسترس نیست، Sendid و همکارانش دلیل اصلی و پایه‌ی منطقی مشابهی برای به حداکثر رساندن توانائی تشخیصی کاندیدازیس تهاجمی با استفاده از آزمایش Platelia Candida Antibody در ترکیب با آزمایش Platelia Candida Antigen را به‌کار بستند.
همانطور که قبلاً ذکر گردید، آزمایش همزمان مانانمی و آنتی‌بادی‌های ضد مانان منتج به بهبود حساسیت از 40 الی 53 درصد با یک آزمایش به 80 درصد با تست‌های ترکیبی می‌شود. به کمک استراتژی‌های تست‌های ترکیبی، اختصاصیت در حد 93 درصد بالا می‌ماند. در حالی که آزمایش Platelia Candida Antigen برای آلفا- مانان اختصاصی است، آزمایش Platelia Candida Antibody آنتی‌بادی‌ها را علیه مجموعه‌ی مانان الیگومانوز که دربردارنده‌ی هر دو اپی‌توپ آلفا- و بتا- مانان است، مورد سنجش قرار می‌دهد.
جدول 1- آزمایش آنتی‌ژنمی (antigenemia) در بیماران مبتلا به کاندیدیازیس تهاجمی
| آنتی‌ژن مورد آزمایش | روش (سازنده) | تعداد بیماران | حساسیت % | اختصاصیت % |
| انولاز | ساندویچ الایزا | 170 | 75 | 96 |
| مانان | الایزا | 209 | 74 | 100 |
| مانان | LA(pastorex) | 72 | 25 | 100 |
| مانان | (EIA) platelia | 193 | 40 | 98 |
| آلفا- مانان | (EIA) platelia | 144 | 69 | 98 |
| بتا- مانان | EIA | 144 | 69 | 95 |
| آلفا- و بتا- مانان | EIA | 144 | 85 | 95 |
| مانان | (EIA) platelia | 60 | 86 | 79 |
| مانان | EIA | 34 | 60 | 92 |
| مانان | LA(pastorex) | 79 | 26 | 100 |
EIA: enzyme immunoassay ELISA: enzyme- linked immunosorbent assay LA: latex agglutination
این محققین و دیگران بر اهمیت پایش سریال و منظم (2 بار در هفته) در بیماران در معرض خطر به‌منظور به حداکثر رساندن حساسیت تست‌های سرودیاگنوستیکی برای تشخیص کاندیدیازیس تهاجمی تأکید می‌نمایند.
کشت گونه‌های مختلف کاندیدا بر روی محیط کروم آگار کاندیدا
در بین هدف‌های (تارگت) آنتی‌ژن‌های پروتئینی مختلف، احتمالاً امیدوارکننده‌ترین آن‌ها برای تشخیص کاندیدیازیس تهاجمی، آنزیم انولاز بوده است. این آنتی‌ژن 48 کیلودالتونی در غیاب فونژمی در گردش خون وجود دارد و با عفونت بافت‌های عمقی مرتبط است. یک روش تجاری‌شده برای اندازه‌گیری آن وجود دارد (Directigen, Becton- Dickenson) که از آنتی‌بادی منوکلونال علیه انولاز استفاده می‌کند و از فرمت دوبل ساندویچ آنتی‌ژن بهره می‌گیرد.
در یک کارآزمایی بالینی آینده‌نگر که در 4 مرکز انکولوژی پزشکی انجام شد، والش (Walsh) و همکارانش نشان دادند که آنتی‌ژنمی انولاز حتی در غیاب فونژمی، یک نشانگر برای تهاجم بافت عمقی توسط گونه‌های کاندیدا بوده است. علاوه بر این، روش ایمیونواسی انولاز سرم به‌عوض جایگزینی، مکمل کشت‌های خون برای تشخیص کاندیدیازیس تهاجمی گردیده است. این آزمایش بسیار اختصاصی (96%) است و هنگامی که از نمونه‌های متعدد برای هر بیمار استفاده می‌شود، حساسیت آن در بیماران با عفونت عمقی 85 درصد و در موارد ثابت‌شده‌ی کاندیدمی معادل 64 درصد است.
هر دو گروه محققین شامل Gutierrez و همکارانش که از آزمایش Directigen استفاده کردند و Mitsutake و همکارانش که از آزمایش dot- immunobinding استفاده کردند، نقش اندازه‌گیری انولاز را در تشخیص کاندیدیازیس تهاجمی مورد تأکید قرار دادند. متأسفانه تست Directigen برای اندازه‌گیری انولاز در دسترس نیست و منابع تجارتی دیگری برای روش‌های سنجش انولاز وجود ندارد.
کاندیدا مقادیر زیادی د- آرابینیتول در کشت و در طول دوره‌ی بیماری تهاجمی (IC) تولید می‌کند. باید توجه داشت که کاندیدا گلابراتا و کاندیدا کروزی این متابولیت را تولید نمی‌کنند. چندین گروه از محققین نشان داده‌اند که غلظت‌های د- آرابینیتول سرم و نسبت‌های د- آرابینیتول به کراتینین در افراد مبتلا به کاندیدیازیس تهاجمی در مقایسه با افراد گروه کنترل که مبتلا نبوده‌اند و یا صرفاً کلونیزاسیون کاندیدا داشته‌اند، بالاتر بوده است. مقادیر بالا رفته‌ی نسبت د- آرابینیتول به کراتینین در سرم یا ادرار بیماران مبتلا اغلب قبل از آنکه کشت خون مثبت نشان بدهند، وجود داشته است و نسبت‌ها با پاسخ‌های درمانی همبستگی نشان داده‌اند.
Walsh و همکارانش از یک روش خودکار آنزیماتیک برای سنجش میزان د- آرابینیتول در سرم استفاده کرده و یک مطالعه‌ی چندمرکزی آینده‌نگر را انجام دادند. این مطالعه بر روی بیماران دچار کنسر و نوتروپنیک با خطر زیاد و گیرندگان BMT انجام گردید و نشان داده شد که اکثر بیماران (74%) مبتلا به کاندیدیازیس تهاجمی نسبت‌های بالایی از د- آرابینیتول به کراتینین در سرم داشتند و تغییر در این نسبت در طول زمان با پاسخ به درمان‌های ضد قارچی مطابقت داشت.
نتایج یک مطالعه‌ی مبتنی بر جمعیت بزرگ از بیماران انتخاب‌نشده با کاندیدمی نشان داد که اندازه‌گیری‌های د- آرابینیتول به کراتینین روشی حساس، اختصاصی و به‌موقع برای سنجش اولیه‌ی کاندیدمی در بیماران با یک طیف وسیع از شرایط زمینه‌ای بود، مانند آنچه قبلاً در مورد بیماران سرطانی و سایر جمعیت‌های خاص گزارش گردیده بود.
تصویری شماتیک از اجزای دیواره سلولی قارچ
بتا- 1 و 3 گلوکان (BG) یک جزء مهم دیواره‌ی سلولی کاندیدا، آسپرجیلوس و بسیاری از دیگر قارچ‌های پاتوژن است. اگرچه بتاگلوکان ایمنوژنیک نیست، اما با توجه به اینکه در جریان خون بیماران مبتلا به عفونت‌های مهاجم قارچی وجود دارد، برای استفاده‌ی تشخیصی به‌عنوان نشانگر جایگزین عفونت می‌تواند بکار گرفته شود.
Fungitel BG assay یک روش اندازه‌گیری کالریمتریک تأییدشـــده توســـط FDA اســـت (Associates of cape cod Inc, Falmouth,MA) که می‌تواند به‌طور غیرمستقیم غلظت بتاگلوکان در سرم را تعیین کند. سیستم سنجش بر اساس فعال شدن آبشار انعقادی پروتئولیتیک حساس به بتاگلوکان است که اجزای آن از خرچنگ نعل اسبی تهیه و خالص شده است.
آزمایش می‌تواند مقادیر بتاگلوکان را در سطح پیکوگرم اندازه‌گیری نماید و برای نشان دادن حضور پلی‌ساکارید در سرم بیماران مبتلا به کاندیدیازیس تهاجمی و آسپرجیلوزیس تهاجمی استفاده شده است، اما در کریپتوکوکوزیس یا زایگومایکوزیس (ارگانیسم‌هائیی که فاقد بتاگلوکان هستند) کاربرد ندارد.
نگاهی بر کاندیدیازیز دستگاه پیشابی
مروری برعفونت‌های قارچی مجاری ادراری
پاسخ سیستم ایمنی در برابر قارچ‌ها (3)
عفونت‌های قارچی منتشره از راه خون (1)
برای دانلود پی دی اف بر روی لینک زیر کلیک کنید
ورود / ثبت نام