ادامه مبحث تایپینگ مولکولی

روش‌های تایپینگ بر اساس PCR

PCR یک واکنش بیوشیمیائی در آزمایشگاه است که به ما این اجازه را می‌دهد تا مقدار زیادی از سکانس اسید نوکلئیک هدف را تهیه نمائیم. این روش نیازمند DNA الگو از ارگانیزمي که می‌خواهد تیپ بندی شود، دو جفت پرایمر اولیگو نوکلئوتیدی که از روی کنارهای DNA الگو طراحی می‌شود و DNA پلی‌مراز مقاوم به گرما می‌باشد.

تکنیک‌های تایپینگ سویه‌ها بر اساسPCR جهت تولید چندین باند که انگشت نگاری خاصی برای گونه‌ها یا سویه‌های خاص میکرارگانیزم ایجاد می‌کند، طراحی می‌شود. برخلاف تست‌های تشخیصی که حضور یا حذف میکروارگانیزم (یا اسید نوکلئیک آن) در نمونه مورد استفاده قرار می‌گیرد، آنها می‌بایست چندین باند DNA برای اینکه قدرت تمایز مناسب داشته باشند تولید نمایند و این الگوهای باند در میان ایزوله‌ها قابل تکرار باشند، بطوریکه ایزوله‌هایی که دارای چنین الگوهایی نیستند، از گروه خارج شوند.

Multiplex-PCR

همانطورکه قبلاً اشاره شد Multiplex-PCR براي افزایش کارآمدی PCR جهت تایپینگ و شناسائی و کاهش قیمت معرف‌ها طراحی گردید. در این روش چندین جفت پرایمر در یک لوله آزمایش در یک واکنش شرکت می‌کنند. استراتژی کلیدی در این روش طراحی پرایمرها است، بگونه‌ای که دمای annealing این پرایمرها نزدیک به هم باشد تا بتوانند محصولات آمپلی شده با اندازه‌های متفاوت را ایجاد نمایند. اگر محصولات آمپلی شده دارای اندازه‌های یکسانی باشند، شناسائی محصولات به سختی انجام می‌شود. نگرانی بعدی با Multiplex-PCR این است که هنگامی که پرایمرها در یک لوله با هم مخلوط می‌شوند، ممکن است در مراحل آمپلی شدن با یکدیگر تداخل ایجاد کنند، لذا اپتیمایز کردن واکنش بسیار مشکل می‌شود (به خصوص زمانی که تعداد جفت پرایمرها افزایش می‌یابد).

RAPD-PCR و AP-PCR

PCR با پرایمرهای اختیاری و PCR پلی‌مورفیک که به صورت راندم آمپلی می‌شوند خیلی شبیه به هم هستند. در این دو روش پرایمرهای راندم که هدف خاصی را روی DNA الگو ندارند برای آمپلیفیکاسیون مورد استفاده قرار می‌گیرند. کلید اصلیRAPD-PCR وAP-PCR در داشتن درجه حرارت annealing پائین پرایمرها و پرایمرهای با طول کمتر از 10 نوکلئوتید می‌باشد (شکل 1)، بطوریکه در این دمای پائین به پرایمرها این اجازه داده می‌شود که به نقاط مختلف DNA الگو متصل شوند. آمپلیفیکاسیون در این دو نوع PCR زمانی اتفاق می‌افتد که یک پرایمر در دو جهت مخالف به DNA الگو در نزدیکی هم باند کرده باشند. در این صورت قطعه بین این دو پرایمر سنتز می‌شود. اگرچه این روش نسبت به سایر روشهاي تایپینگ مولکولی سریعتر می‌باشد، ولی حساسیت متغیری نسبت به آنها دارد. اگر تغییرات در شرایط واکنش یا معرف‌ها در هنگام AP-PCR مشخص نباشد نتایج به سختی تکرار می‌شوند و تمایز بین باندها تولید شده مشکل است و تایپینگ سویه یک شیوع با مشکل مواجه می‌شود. ولی اگر شرایط کامل کنترل شود AP-PCR یک ابزار قدرتمند در تمایز (به خصوص زمانی که چندین آمپلیفیکاسیون با چندین پرایمر متفاوت انجام می‌شود) است. همچنین گزارش دهی نتایج AP-PCR بعضی مواقع مشکل است، چرا که تغییرات AP-PCR با حوادث ژنتیکی خاصی در سویه ارتباط پیدا نمی‌کند، بنابراین اگر سویه‌های تیپ بندی شده دارای الگوی قطعات یکسان یا الگوهایی با 3 یا بیش از 3 قطعه متفاوت ایجاد نمایند، گزارش‌دهی راحت‌تر خواهد بود، اما هیچ خصوصیات خاصی در هنگامی که یک باند در سویه‌ها تغییر می‌کند، وجود ندارد. در مواقعی که سویه‌های مورد بررسی یک یا دو باند متفاوت از سویه شیوع ایجاد می‌کنند، بعضی اوقات ممکن است یک پرایمر جایگزین استفاده شود یا اینکه شرایط واکنش تغییر داده شود. در برخورد با این مشکلات ضروری است که قدرت تمایز و تکرار پذیری هر پرایمر و پروتکل آمپلیفیکاسیون با مجموعه آنالیزهای ایزوله‌ها که قبلاً توسط مطالعات اپیدمیولوژیکی بدست آمده است، اعتبارسنجی گردند.

شکل 1: نمای کلی از RAPD- PCR

AFLP

پلی‌مورفیسم طول قطعات آمپلی شده، یک روش تایپینگ می‌باشد که در آن محصول هضم DNA توسط آنزیم‌های محدودالاثر و PCR با هم ترکیب شده‌اند. در روشAFLP ، DNA با دو اندونوکلئاز محدودالاثر متفاوت (معمولاً یک برش فراوان‌تر از دیگری ایجاد می‌کند) برش داده می‌شود. این هضم آنزیمی قطعات زیادی ایجاد می‌کند. برای گزارش‌دهی تنها مجموعه خاصی برای مقایسه ایزوله‌ها بکار می‌رود. زیرمجموعه تولید شده (قطعات حاصل از هضم) را در داخل یک لینكر (Linker) یا آداپتور که دارای سایت‌های برش در انتهای قطعات DNA می‌باشند، قرار می‌دهند. پرایمرهای PCR برای هیبرید با سکانس آداپتور یا لینكر، باقی مانده سکانس سایت برش و یک یا دو نوکلئوتید ناشناخته الگو طراحی می‌شوند. با اضافه شدن هر نوکلئوتید (که به صورت راندم انتخاب می‌شود) در انتهای پرایمرها، تعداد قطعاتی که آمپلی می‌شوند، کاهش می‌یابد. بدنبال PCR، محصولات واکنش ژل الکترفورز می‌شوند و الگوهای باندها مشاهده می‌گردد. این روش واجد مزایای RFLP به همراه مزیت افزایش حساسیت توسط PCR که در تولید پروفایل‌ها هم تکرارپذیر بوده و هم گزارش‌دهی ساده (توسط نرم افزارها مانند Bionumeries) دارند، می‌باشد.

همانند RAPD-PCRو AP-PCR ,AFLPمی‌تواند برای ارگانیزمی که اطلاعاتی از سکانس ژنومی آن نداریم استفاده شود.

PCR-RLFP

درست همانند RE که برای اتصال DNA کروموزمی باکتری بکار می‌رود این آنزیم‌ها اغلب برای شکست آمپلی‌کون‌ها هم بکار می‌روند. انتخاب آنزیم‌های محدودالاثر در PCR-RFLP باید با دقت انجام شود، چرا که محصولات PCR کوچک‌تر از کروموزم باکتری می‌باشند و احتمالاً کمتر دارای سایت‌های برش هستند. انتخاب آنزیم اصولاً به دانش قبلی ما در خصوص سایت‌های برش در محصول PCR بستگی دارد که متغیر هستند و ابزار مفیدی براي مقایسه سویه‌ها می‌باشند. اندازه محصولات PCR و تعداد سایت‌های برش که احتمالاً وجود دارد توانائی تمایز این تکنیک را محدود می‌کند.

آنالیز RFLP عموماً روی rDNA بطور مستقيم انجام می‌شود. هنگامی محصول PCR با اهداف rDNA با RFLP آنالیز شوند آن به تکنیک ریبوتایپینگ PCR بر می گردد. PCR-RFLP برای همه انواع متفاوت میکرارگانیزم‌ها شامل باکتری‌ها و قارچ‌ها قابل استفاده است، بعلاوه برای مقایسه سویه الگوهای PCR-RFLP برای تمایز ارگانیزم‌ها بکار می‌رود. استفاده از این تکنیک در تمایز ارگانیزم‌ها بستگی به استفاده از پرایمرهای خیلی اختصاصی در PCR دارد. برای مثال این تکنیک برای شناسائی باکتری‌های سخت‌گیر مانند گونه‌های بوردتلا، کلامیدیا، مایکوپلاسماها، انگل‌هایی که سخت تشخیص داده می‌شوند (مانند کرم‌های قلابی شکل و فیلرها) استفاده می‌شود. این تکنولوژی در تمایز گونه‌های نوکاردیا که در بالین حساسیت مختلفی به آنتی‌بیوتیک‌هاي متفاوت نشان می‌دهند، کاربرد فراوان دارد. ژن‌های غیر ریبوزومی که ممکن است برای PCR-RFLP مورد استفاده قرار گیرند عبارتند از: ژن‌های house keeping (مانند ژن rPOB) و هر ژنی که دارای اطلاعات اختصاصی سویه برای گروه خاصی از ارگانیزم‌ها باشد (مانند ژن‌هائی که برای آنزیم هیدرولیز کننده هیپورات در کامپیلوباکتر ژوژنی کد می‌کنند). از نظر اصول این تکنیک مشابه RFLP می‌باشد، با این تفاوت که در اینجا آنزیم‌ها را روی محصول PCR اثر می‌دهیم و بعد با بررسی با انجام ژل الکترفورز، الگوهای متفاوت را مورد ارزیابی قرار می‌دهیم (شکل 2).