الکتروفورز هموگلوبین، پروتئین و CSF

نکته‌های کلیدی آزمایشگاهی در الکتروفورز هموگلوبین، پروتئین و CSF

دکتر حبیب‌اله گل‌افشان عضو هیئت علمی دانشگاه علوم پزشکی شیراز

محمد اسماعیل خدمتی کارشناس ارشد بیوشیمی دانشکده پیراپزشکی شیراز

الکتروفورز سرم و هموگلوبین و مایع مغزی نخاعی از آزمایش‌های مهم روتین در تشخیص طیف وسیعی از بیماری‌ها است. با الکتروفورز سرم نه‌تنها می‌توان باندهای مونوکلونال گاما را در اختلالات پلاسماسل و برخی از انواع لنفوما تشخیص داد، بلکه می‌توان به نکات تشخیصی برای سیروز کبدی، سندروم نفروتیک و بیماری‌های ریوی ناشی از کمبود آنتی‌تریپسین و نیز افزایش ترشح لیزوزوم‌ها در لوسمی‌های منوبلاستیک پی برد. در این نوشتار به منابع خطا که به‌صورت روتین در الکتروفورز و تفسیر آن رخ می‌دهد، اشاره شده است.

مشکلات شایع در الکتروفورز سرم

• الکتروفورز پلاسما به‌جای سرم ایجاد باند فیبرینوژن می‌کند. باند فیبرینوژن بین ناحیه بتا و گاما قرار می‌گیرد و با اضافه کردن کلسیم یا ترومبین به نمونه این باند محو می‌شود.
• چنانچه میزان ترانسفرین بالا باشد مانند آنمی فقر آهن موجب تشکیل باند بلند در ناحیه بتا می‌گردد.
• در سندروم نفروتیک باندهای برجسته در ناحیه آلفا ۲ و بتا مشاهده شده که ربطی به پروتئین‌های مونوکلونال ندارد.
• کمپلکس هموگلوبین و هاپتوگلوبین که در همولیزهای داخلی عروقی مشاهده می‌شود در ناحیه آلفا 2 ایجاد باند می‌کند.
• پروتئین‌های مونوکلونال (M protein) ممکن است ایجاد اشکال دایمر، پنتامر یا پلیمر کنند و از این رو به‌جای باند باریک و بلند، ایجاد باند پهن به‌صورت گستره (broad smear) کنند.
• در آن دسته از لوسمی‌های مالتیپل مایلوم که تنها زنجیره سبک ترشح می‌شود به‌علت دفع سریع ادراری زنجیره‌های سبک، ممکن است الکتروفورز فاقد باند غیرطبیعی مونوکلونال یا باند ضعیف منوکلونال در ناحیه گاما باشد، از این رو مشاهده نشدن باند مونوکلونال در الکتروفورز سرم، لوسمی مالتیپل مایلوم را رد نمی‌کند، بلکه همزمان آزمایش الکتروفورز ادرار برای مشاهده باند گاما سفارش می‌شود.
• باندهای مونوکلونال در ناحیه گاما ظاهر می‌شوند ولی ممکن است در نواحی بتا یا به‌ندرت آلفا 2 ظاهر گردند.
• هنگامی که باند مونوکلونال در الکتروفورز سرم مشاهده گردد، ایمونوفیکساسیون سرم و ادرار ۲۴ ساعته سفارش می‌شود. چنانچه میزان پروتئین M کم باشد ممکن است توسط الکتروفورز سرم مشخص نشود؛ برای مثال در بیماری heavy chain α به علت تمایل زنجیره‌ها برای پلیمر شدن یا محتوای زیاد کربوهیدرات ممکن است باند واضح مشاهده نگردد.
• در μ-HCD (بیماری زنجیره سنگین) یک باند مونوکلونال واضح در ۴۰ درصد موارد مشاهده می‌شود. پان‌هایپوگاماگلوبولینمی از نکته‌های تشخیصی است. در برخی بیماران با IgD Myeloma باند مونوکلونال ممکن است به علت کوچک بودن مورد توجه قرار نگیرد.
• باند فیبرینوژن در غالب موارد در بیمارانی که داروهای ضد انعقاد مصرف می‌کنند و تهیه سرم مشکل است مشاهده می‌گردد.
• پروتئین‌ واکنشگر C (CRP) در میانه نواحی گاما ایجاد باند می‌کند.CRP پروتئین فاز حاد است که در بیماری‌های التهابی و عفونی بالا می‌رود. کاهش آلبومین و افزایش پروتئین‌ها در نواحی آلفا 1 و آلفا ۲ با کاهش ترانسفرین و افزایش کمپلمان از نکات تشخیصی حضور افزایش CRP است.
• لیزوزیم‌ها (muramidase) به‌صورت یک باند کوچک در انتهای کاتودی (extreme cathodal) الکتــروفورز ســرم ظاهر می‌شـــــــوند. این باند ممکن است گویای لوسمی‌های مونوبلاستیک (AML M4 & M5) باشد. لیزوزیم‌ها نیز ممکن است در سرم افراد مبتلا به سل یا سارکوئیدوز افزایش یابند اما نه به حدی که در الکتروفورز ایجاد باند کنند. گفتنی است که باندهای ضعیف در انتهای مرز کاتدی ممکن است ناشی از الکتروفورز سرم در ژل بیش از زمان استاندارد باشد. در این حالت باند ضعیف در تمامی نمونه‌ها ممکن است به‌ویژه در نمونه‌هایی که افزایش پلی‌کلونال ایمونوگلوبولین دارند، دیده شود.

الگوی قرار گرفتن ایمونوگلوبولین‌های مختلف، اجزای کمپلمان، پروتئین‌های فاز حاد و نیز پروتئین‌های طبیعی بدن در الکتروفورز سرم

الکتروفورز سرم در سندرم نفروتیک افزایش گلوبولین آلفا 2 به همراه کاهش آلبومین را نشان می‌دهد. کمبود آنتی‌تریپسین با کاهش باند در ناحیه‌ی آلفا مشاهده می‌شود. الگوی مونوکلونال ایمونوگلوبولین در مالتیپل مایلوما و افزایش پلی‌کلونال آن در بیماری‌های روماتیسمی مشاهده می‌گردد. الکتروفورز ادرار بیمار مبتلا به مالتیپل مایلوما حضور پروتئین بنس جونز را به‌صورت منحنی بلند نشان می‌دهد

 در سیروز کبدی افزایش باند بتا در گاما ادغام شده و پل بتا – گاما مشاهده می‌گردد

جداسازی پروتئین‌های سرم بر مبنای جریان الکترواسموتیک قوی‌تر از جریان عادی بوده و منجر به رها شدن و شناسایی پروتئین‌های مختلف در انتهای کاتدی ستون می‌گردد

الکتروفورز هموگلوبین

الکتروفورز هموگلوبین با روش‌های گوناگون از قبــــیل حرکـــــت هموگلوبیــــن‌ها روی استات سلولز، HPLC ،Capillary zone  و بر پایه نقطه ایزوالکتریک (IEF)  انجام می‌شود

مهم‌ترین نکات مورد بحث در مورد الکتروفورز عبارتند از:

• خطای انتقال نمونه (CARRY OVER) در روش HPLC
• تزریق خون در حالی که اهداکننده هتروزیگوت داسی یا هتروزیگوت هموگلوبین C باشد.
• تزریق خون افراد سالم (AA) به بیماران مبتلا به هموزیگوت داسی و سندرم‌های تالاسمی ‌مانند هموزیگوت دلتا بتا، هموزیگوت لپور، تالاسمی ماژور⁰ β و HPFH هموزیگوت که در کلیه موارد فوق انتظار مشاهده باند A نیست و موجب ظاهر شدن باند A ناشی از ترانسفیوژن می‌شود.
• داروهایی از قبیل هیدروکسی اوره، والپورات، آزوسایتیدین موجب افزایش هموگلوبین F می‌شوند.
• آنمی فقر آهن مقدار هموگلوبین A₂ را در آن دسته از سندرم‌های تالاسمی مینور که با افزایش خفیف HbA₂ همراه است در طیف نرمال قرار می‌دهد. آنمی فقر آهن حدود 0/5 درصد HbA2 را کاهش می‌دهد.
• ابتلا به HIV در طی درمان موجب افزایش کاذب سطح هموگلوبین A₂ می‌شود.
• هموگلوبین‌های فاست (Fast) مانند هموگلوبین H و هموگلوبین بارت با روش HPLC قابل سنجش کمی نیستند.
• در ۱۵ تا ۲۰ درصد موارد حاملگی هموگلوبین F ممکن است به سطح ۵ درصد برسد.
• لوسمی‌های M6 (اریترولوسمی) و لوسمی میلومونوسیتیک جوانی (JMML) با افزایش هموگلوبین F همراه هستند. کم‌خونی آپلاستیک ممکن است موجب افزایش هموگلوبین F گردد.
• از مهم‌ترین واریانت‌های هموگلوبین A₂، هموگلوبین A’₂ با جهش در زنجیره دلتا است که به‌صورت هموزیگوت یا هتروزیگوت به ارث می‌رسد. در حالت هتروزیگوت مقدار آن یک تا دو درصد است که با روش‌های معمول شناسایی نمی‌شود ولی به‌سادگی با روش‌های کاپیلاری و HPLC قابل تشخیص است. با HPLC در دریچه S الوت می‌شود و از این رو در هتروزیگوت وهموزیگوت داسی نمی‌توان آن را تشخیص داد. هموگلوبین C قندی در هتروزیگوت (AC) و هموزیگوت (CC) نیز در دریچه S الوت می‌شود. هموگلوبین S قندی در HPLC در دریچه هموگلوبین A قرار می‌گیرد و از این رو هموزیگوت داسی ممکن است با دوبل داسی و تالاسمی ⁺S/β اشتباه گردد. در تالاسمی مینور بتا مقدار کل هموگلوبین A₂ برابر A₂ و A’₂ است.
• چنانچه در هتروزیگوت داسی مقدار هموگلوبین S کمتر از ۳۵ درصد شود، همراه آن با تالاسمی آلفا مطرح می‌شود.

چالش‌های رایج در الکتروفورز هموگلوبین در تابلوی فوق مشاهده می‌شود. در تابلوی فوق به خطای انتقال نمونه و ترانسفیوژن اخیر که موجب افزایش هموگلوبین A می‌گردد و نیز به داروها مانند هیدروکسی اوره که موجب افزایش هموگلوبین F می‌شود اشاره شده است. آنمی فقر آهن موجب کاهش 0/5 درصدی هموگلوبین A2 می‌گردد. از واریان‌های مهم هموگلوبین A2 و A′2 به‌عنوان هموگلوبین A2 بایستی برای بیمار گزارش گردد

 

در شکل فوق انواع روش‌های الکتروفورز و الگوی الکتروفورز هموگلوبین روش استات سلولز در PH قلیایی به‌عنوان روش مادر مشاهده می‌گردد. جایگاه هموگلوبین A به‌عنوان شاخص قرار گرفته و هموگلوبین‌های H و بارت که حرکتی سریع دارند به‌عنوان گروه Fast و هموگلوبین‌های دیگر با حرکت کند جای می‌گیرند. کندترین حرکت‌ها مربوط به هموگلوبین‌های A2 و A′2 و کنستانت اسپرینگ است. توجه داشته باشید که هموگلوبین لپور اندکی جلوتر از جایگاه S و گاهی در همان جایگاه S قرار می‌گیرد و از این رو در شکل فوق جایگاه لپور اندکی آنودیک‌تر رسم شده است

واریانت‌های مهم هموگلوبین بر اثر جهش در زنجیره‌ی بتا و آلفا و گاما مشاهده می‌شود

الکتروفورز مایع مغزی نخاعی

الکتروفورز مایع مغزی نخاعی برای مشاهده باندهای اولیگوکلونال(Oligoclonal)  و محاسبه اندکس سنتز IgG در تشخیص موارد مشکوک به مولتیپل اسکلروز (MS)بسیار ارزشمند است. در ۹۵ درصد بیماران که تشخیص قطعی MS است، حداقل دو باند پلکانی در الکتروفورز مایع مغزی نخاعی در منطقه گاما مشاهده می‌شود. باندهای پلکانی باندهای مجزای IgG یا به‌ندرت IgA و IgMهستند. الکتروفورز سرم بایستی همزمان با الکتروفورز مایع مغزی نخاعی صورت گیرد و سرم فاقد باندهای الیگوکلونال باشد، بایستی مطمئن شد که نمونه CSF واقعی است و مشاهده باندهای پره‌آلبومین و ترانسفرین بتا دو (ترانسفرین فاقد اسید سیالیک) در الکتروفورز مایع مغزی نخاعی بیانگر CSF خالص است.

البته مشاهده باندهای الیگوکلونال مترادف بیماری MS نیست، بلکه این الگو در بیماری لایم، اختلالات لنفوپرولیفراتیو، بیماری‌های اتوایمیون و تومور مغزی ممکن است مشاهده شود. در MS اندکس سنتز IgG بیشتر از 0/8درصد می‌گردد. در بیماریMS  نمونه مایع مغزی نخاعی از نظر شمارش سلولی در بیشتر موارد نرمال و در مواردی ممکن است افزایش یابد و به‌ندرت به ۵۰ سلول در میلی‌متر مکعب می‌رسد. در شمارش افتراقی لنفوسیت سلول غالب است.

در تهیه نمونه CSF فشار مغزی هم اندازه‌گیری می‌شود. نمونه CSF در 3 لوله 1 و 2 و 3 تهیه می‌شود. لوله شماره یک برای آزمایش‌های شیمی و سرولوژی و لوله شماره 2 برای میکروب‌شناسی و لوله شماره 3 برای شمارش سلولی بکار می‌رود، چون کمترین آلودگی سلولی را دارد. نمونه CSF را قبل از کشت هرگز در یخچال قرار ندهید زیرا میکروب‌های خانواده نایسریا و H.influ به سرما حساس هستند و از بین می‌روند

باندهای الیگوکلونال باندهای مجزای IgG هستند که به‌صورت پلکانی بین ۲ تا ۸ عدد در ناحیه گامای الکتروفورز قرار می‌گیرند. با الکتروفورز همزمان سرم و مایع نخاعی می‌توان الگوهای مختلف باندهای الیگوکلونال را مشاهده کرد. وجود باندهای الیگوکلونال IgG در CSF و نبود آنها در سرم (الگوی تایپ دو با توجه به شکل) از نقاط تشخیصی MS است.

از الکتروفورز CSF برای تشخیص بیماری مالتیپل اسکلروز زمانی استفاده می‌شود که پرتونگاری MRI مغز مشکوک باشد. افزایش اندکی IgG و مشاهده‌ی باندهای الیگوکلونال در MS و برخی دیگر از بیماری‌های نورولوژیک مشاهده می‌شود. باندهای الیگوکلونال به‌صورت پلکانی بین 2 تا 8 عدد در ناحیه‌ی گاما ایجاد می‌شوند و ارزش واقعی آن‌ها زمانی است که الکتروفورز سرم برای باندهای پلکانی منفی و در مورد CSF مثبت باشد

آنالیز مایع مغزی نخاعی (CSF) برای تشخیص بیماری‌های سیستم عصبی مرکزی

https://www.webmd.com/a-to-z-guides/what-is-hemoglobin-electrophoresis

برای دانلود پی دی اف بر روی لینک زیر کلیک کنید