اصول کشت سلول سرطانی HT-29 در سرطان کولون

اصول کشت سلول سرطانی HT-29 در سرطان کولون

اصول کشت سلول سرطانی HT-29 در سرطان کولون

الهام احمدی (دانشجوی کارشناسی ارشد بیوتکنولوژی پزشکی)

حسن اسدی (کارشناس آزمایشگاه)

سلول‌ها برای رشد نیازمند مواد مغذی و فاکتورهای رشد و فضای کافی هستند. جهت تکثیر سلول‌های رده‌ی سلولی HT-29 سرطان کولون از فلاسک های t-75 و t-25 می‌توان استفاده کرد. هنگامی‌که تعداد سلول‌های داخل فلاسک زیاد شود و confluency به ۱۰۰ برسد سلول‌ها فضای کافی برای رشد نداشته و نیاز است که سلول‌ها پاساژ داده شوند. بسته به نیاز می‌توان سلول‌ها را به ۲ یا ۳ فلاسک پاساژ داد. بعد از پاساژ که به تعداد کافی سلول در اختیار داریم می‌توانیم از سلول‌ها backup بگیریم به این صورت که ذخیره‌سازی سلول‌ها در تانک ازت (نیتروژن مایع) امکان استفاده از سلول‌ها را به مدت طولانی (۲ یا ۳ سال) فراهم می‌سازد.

برای کشت سلول‌های جانوری نیازمند محیط کشت هستیم که شرایطی مثل کربن، نیتروژن و منابع موردنیاز برای تغذیه سلول را فراهم کند. محیط کشت مورداستفاده برای سلول‌های سرطانی HT-29،
RPMI1640 (Roswell Park Memorial Institue) است. برای تهیه‌ی ۱Lit محیط کشت RPMI 10.43gr پودر RPMI،۲ gr NaHco3 ،  ۸۰mg Penicillin و ۵۰mg streptomycin وزن کرده و در ۹۰۰ml آب اتوکلاو شده حل می‌کنیم.

نکته: آنتی‌بیوتیک معمولاً جهت پیشگیری از آلودگی است و برای باکتری‌های گرم مثبت و منفی و قارچ‌ها استفاده می‌شود.

برای اینکه موارد فوق کامل حل شوند، داخل شیشه مگنت انداخته و آن را روی stirrer قرار می‌دهیم تا یک محلول کاملاً شفاف حاصل شود. سپس برای تعیین PH محلول از PHمتر استفاده می‌کنیم.PH  محیط کشت باید بین ۷٫۴-۷٫۲ باشد. اگر کمتر از این مقدار بود با اضافه کردن NaOH یا KOH 0.1 مولار محیط را قلیایی می‌کنیم؛ اما اگر PH بیشتر از محدوده‌ی فوق بود از HCL 0.1 مولار برای اسیدی‌تر کردن محیط استفاده می‌کنیم تا PH در این محدوده ثابت شود.

در مرحله بعدی محیط کشت آماده را با فیلترهای سرسرنگی ۰٫۲ میکرون فیلتر می‌کنیم تا یک محیط کشت کاملاً استریل داشته باشیم.

نکته: با اتوکلاو کردن هم می‌توان آلودگی را از بین برد ولی اتوکلاو برای همه‌ی ترکیبات قابل‌اجرا نیست بنابراین از فیلتراسیون استفاده می‌کنیم. قبل از استفاده از محیط کشت جهت اطمینان می‌توانیم ۵ml از محیط کشت را داخل فالکون ۱۵ml ریخته و به مدت ۲۴h داخل انکوباتور قرار داده تا چنانچه آلودگی در محیط کشت وجود داشت با تغییر رنگ محیط از صورتی به زرد (شفاف به کدر) مشخص گردد.

سلول‌ها جهت تکثیر و رشد به FBS (Fetal Bovin Serum) نیاز دارند که به‌صورت ۱۰% استفاده می‌کنیم یعنی داخل ۹۰۰ml محیط کشت،۱۰۰ml FBS  اضافه می‌کنیم. محیط کشت کامل (FBSدار) بیشتر از دو هفته قابل‌استفاده نیست بنابراین می‌توان FBS را در هر مرحله از کار به‌صورت جداگانه به محیط اضافه کرد. در این صورت محیط کشت به مدت ۳-۲ ماه قابل‌استفاده خواهد بود.

جهت فریز سلول‌ها را در نیتروژن مایع نگه‌داری می‌کنند برای استفاده مجدد از این سلول‌های فریز شده باید  سلول‌ها را دفریز کنیم. سلول‌هایی که از تانک ازت ۱۹۶- درجه سانتیگراد خارج می‌شوند بسیار حساس هستند. برای اینکه سلول‌ها از حالت منجمد خارج شوند ابتدا کراتیوب به مدت ۱۰ دقیقه در فریزر در دمای۲۰- قرار می‌دهیم تا به سلول‌ها شوک وارد نشود بعد از ۱۰ دقیقه کرایوتیوب را داخل انکوباتور دمای ۳۷ درجه سانتیگراد قرار می‌دهیم تا کاملاً ذوب شوند اما بایستی دقت کرد که به‌محض ذوب شدن سلول‌ها را داخل فلاسک منتقل کنیم تا از بین نروند. برای این کار ابتدا از قبل زیر هود داخل فالکون ۱۵ml محیط کشت کامل (۴ml محیط کشت + ۱mlFBS) می‌ریزیم تا به‌محض ذوب شدن سلول‌ها را داخل این فالکون منتقل کنیم.

نکته: FBS در اینجا جهت خنثی کردن اثر DMSO (Dimethyl Sulfoxide) است که در مرحله فریز استفاده کرده بودیم.

بعد از انتقال سلول‌ها به داخل فالکون، سوسپانسیون سلولی را به‌آرامی پیپتاژ (up and down) می‌کنیم. سپس فالکون حاوی سلول‌ها به مدت ۵ دقیقه در دور ۲۵۰۰RPM سانتریفوژ می‌کنیم. پس از سانتریفوژ محیط رویی را خارج کرده و رسوب سلولی را در ۲cc محیط کشت بدون FBS حل می‌کنیم سپس سلول‌ها شمارش شده و درصد سلول‌های زنده تعیین می‌گردد. شمارش با رنگ‌آمیزی توسط تریپان‌بلو تعیین می‌گردد به این‌صورت‌که سلول‌های زنده نسبت به رنگ نفوذ ناپذیرند و حال‌آنکه سلول‌های مرده رنگ را جذب می‌کنند بسته به تعداد سلول‌های زنده، تعداد فلاسک جهت رشد و تکثیر مشخص می‌گردد. بعد از شمارش سلول‌ها و حل رسوب در FBS، سوسپانسیون سلولی را به فلاسک (T-75 یا T-25) منتقل می‌کنیم.

چنانچه فلاسک مورداستفاده T-75 باشد (۹ml محیط کشت+۱mlFBS ) و اگر فلاسک T-25 باشد (۴ml محیط کشت + ۱ml FBS) استفاده می‌شود. نهایتاً فلاسک را داخل انکوباتور منتقل می‌کنیم و بدین ترتیب سلول‌ها روند رشد و تکثیر را آغاز می‌کنند.

ازآنجایی‌که رشد و تکثیر رده سلولی HT-29 بسیار زیاد است هر یک روز در میان نیاز به تعویض محیط است. جهت تعویض به محیط کشت، FBS، پیپت پاستور، سرسمپلر ۱۰۰۰ نیاز است. ابتدا محیط داخل فلاسک را با پیپت پاستور استریل خارج کرده و سپس به بسته به نوع فلاسک (۹ml محیط کشت+ ۱mlFBS )  T-75 یا  T-25 (4ml محیط کشت + ۱ml FBS) اضافه می‌کنیم. سپس در فلاسک را بسته و به انکوباتور منتقل می‌کنیم.

 

نکته: تمام مواد و وسایل فوق قبل از استفاده باید الکل‌کشی شده و سپس زیر هود منتقل شود و تمام مراحل تعویض محیط باید زیر هود انجام شود.

بسته به cell line موردنظر و doubling time تعداد دفعات پاساژ فرق می‌کند. هنگامی‌که تعداد سلول‌ها داخل فلاسک بیش‌ از حد گردد و confluency به ۱۰۰ برسد نیاز است که سلول‌ها پاساژ داده شوند.

نکته: پاساژ سلول‌های adherent با سلول‌های suspension متفاوت است.

ازآنجایی‌که سلول‌های رده سلولی HT-29 به کف فلاسک متصل می‌شوند طبق مراحل زیر عمل می‌کنیم:

۱) محیط داخل فلاسک را کاملاً تخلیه کرده و کف فلاسک را با ۳-۲ CC از محلول PBSشست‌وشو می‌دهیم.

نکته: شست‌وشو با PBS جهت حذف FBS محیط است. چون اگر FBS حذف نشود تریپسین نمی‌تواند عملکرد خود را انجام دهد چون‌که پروتئین‌های FBS در جایگاه فعال آنزیم تریپسین قرار می‌گیرند و مانع فعالیت آنزیم می‌شوند.

 

نکته: پروتکل تهیه‌ی یک لیتر PBS:

۸gr NaCl، ۰٫۲gr kcl،۱٫۴۴gr Na2HPO4  و ۰٫۲۴gr KH2PO4  را با آب دیونیزه به حجم ۱۰۰۰cc می‌رسانیم سپس PH را در ۷٫۴ تنظیم می‌کنیم سپس اتوکلاو کرده و در دمای ۴ درجه نگهداری می‌کنیم.

۲) PBS داخل فلاسک را خارج کرده و آنزیم تریپسین به فلاسک اضافه می‌کنیم در حدی که کف فلاسک را کاملاً بپوشاند. فلاسک را به مدت ۵-۲ دقیقه (بسته به نوع سلول) به انکوباتور ۳۷ درجه سانتیگراد منتقل می‌کنیم.

نکته: آنزیم تریپسین سلول‌های چسبیده به کف فلاسک و همین‌طور سلول‌های چسبیده به هم را جدا می‌کند.

۳) فلاسک را از انکوباتور خارج کرده و زیر میکروسکوپ از جدا شدن سلول‌ها از بستر فلاسک و همدیگر اطمینان حاصل می‌کنیم. اگر هنوز اتصال برقرار بود مدت‌زمان انکوباسیون را بیشتر کرده و یا اینکه به کف فلاسک به‌آرامی چند ضربه می‌زنیم. بعد از جدا شدن سلول‌ها از کف فلاسک cc 2-3 از FBS داخل فلاسک اضافه کرده و پیپتاژ می‌کنیم.

 نکته: FBS با قرارگیری در جایگاه فعال آنزیم اثر تریپسین را خنثی می‌کند چون این آنزیم ممکن است به غشای سلول آسیب برساند بنابراین سریعاً باید خنثی‌سازی را انجام دهیم.

۴) بعد از پیپتاژ سوسپانسیون سلولی داخل فلاسک را به یک فالکون استریل ۱۵ml منتقل می‌کنیم و به مدت ۵ دقیقه در دور ۲۵۰۰rpm سانتریفوژ می‌گذاریم. بعد از ۵ دقیقه سانتریفوژ محلول رویی را خارج کرده و روی رسوب ۳cc محیط اضافه می‌کنیم و پیپتاژ می‌کنیم.

۵) بعد از پیپتاژ سوسپانسیون سلولی را به ۲ فلاسک پاساژ می‌کنیم (subculture). بسته به نوع فلاسک مورداستفاده (۹mlمحیط کشت+۱mlFBS ) T-75 یا T-25(4ml محیط کشت + ۱ml FBS) به هرکدام ۱٫۵cc از سوسپانسیون اضافه می‌کنیم. نهایتاً فلاسک را به انکوباتور منتقل می‌کنیم.

وقتی تعداد سلول‌های داخل فلاسک به confluency100 رسید می‌توان دوباره پاساژ انجام داد یا اینکه سلول‌ها را فریز کرد. تهیه‌ی backup از سلول‌ها امکان استفاده از سلول‌ها را به مدت طولانی فراهم می‌سازد.

جهت فریز کردن سلول‌ها مراحل ۱،۲،۳،۴ پاساژ را به ترتیب انجام می‌دهیم. سپس سوسپانسیون سلولی را شمارش کرده و بر اساس تعداد سلول‌ها تصمیم می‌گیریم که به چند کراتیوب جهت فریز نیاز داریم. روی کرایوتیوب مشخصات رده سلولی، تاریخ فریز و نام خودمان را می‌نویسیم. برای فریز ۵۰۰λ سوسپانسیون سلولی، ۴۰۰λ FBS و ۱۰۰λ DMSO به داخل کرایوتیوب اضافه می‌کنیم و پیپتاژ می‌کنیم. بعد از اضافه کردن DMSO سریعاً کرایوتیوب را به دمای ۲۰- درجه سانتیگراد به مدت ۲۰ دقیقه منتقل کرده و بعد از ۲۰ دقیقه به مدت ۲۴h در دمای ۸۰-درجه سانتیگراد نگهداری می‌شود و بعد از ۲۴h سلول‌های منجمد  به تانک نیتروژن (۱۹۶-درجه سانتیگراد) منتقل می‌شود.

در تمام مراحل جهت استریل بودن کار و ممانعت از آلودگی‌های احتمالی از الکل ۷۰% استفاده می‌کنیم.

 

 

References:

  1. Portela VM, Zamberlam G, Price CA (April 2010). “Cell plating density alters the ratio of estrogenic to progestagenic enzyme gene expression in cultured granulosa cells”. Fertil. Steril. 93 (6): 2050–۵٫
  2. Drexler, HG; Dirks, WG; MacLeod, RA (Oct 1999). “False human hematopoietic cell lines: cross-contaminations and misinterpretations”. Leukemia. 13 (10): 1601–۷٫
  3. Liscovitch, M; Ravid, D (Jan 2007). “A case study in misidentification of cancer cell lines: MCF-7/AdrR cells (re-designated NCI/ADR-RES) are derived from OVCAR-8 human ovarian carcinoma cells”. Cancer Letters. 245 (1–۲): ۳۵۰–۲٫
  4. Macleod, RA; Dirks, WG; Matsuo, Y; Kaufmann, M; Milch, H; Drexler, HG (Nov 1999). “Widespread intraspecies cross-contamination of human tumor cell lines arising at source”. International Journal of Cancer. Journal International Du Cancer. 83 (4): 555–۶۳٫
  5. Nguyen, H. T.; Geens, M.; Spits, C. (2012). “Genetic and epigenetic instability in human pluripotent stem cells”. Human Reproduction Update. 19 (2): 187–۲۰۵٫
  6. Hayflick, L. (September 1998). “A brief history of the mortality and immortality of cultured cells”. Keio J Med. 3. 47 (3): 174–۱۸۲٫
  7. Maguire G (2016) Therapeutics from Adult Stem Cells and the Hype Curve. ACS Med. Chem. Lett. 7 (5): 441–۴۴۳٫
  8. Dupont, Sirio; Morsut, Leonardo; Aragona, Mariaceleste; Enzo, Elena; Giulitti, Stefano; Cordenonsi, Michelangelo; Zanconato, Francesca; Le Digabel, Jimmy; Forcato, Mattia; Bicciato, Silvio; Elvassore, Nicola; Piccolo, Stefano (2011). “Role of YAP/TAZ in mechanotransduction”. Nature. 474 (7350): 179–۸۳٫
  9. Barrila, Jennifer; Radtke, Andrea L.; Crabbé, Aurélie; Sarker, Shameema F.; Herbst-Kralovetz, Melissa M.; Ott, C. Mark; Nickerson, Cheryl A. (2010).
  10. Edmondson, R., Broglie, J. J., Adcock, A. F., & Yang, L. (2014). Three-Dimensional Cell Culture Systems and Their Applications in Drug Discovery and Cell-Based Biosensors. Assay and Drug Development Technologies, 12(4), 207–۲۱۸٫

سرطان کولون (روده بزرگ) چیست؟

بازیدیوبلومایکوزیس روده‌ای

برای دانلود پی دی اف بر روی لینک زیر کلیک کنید

 

برچسبها
  • HT-29
  • الهام احمدی
  • حسن اسدی
  • سرطان کولون

دیدگاهتان را بنویسید

نشانی ایمیل شما منتشر نخواهد شد. بخش‌های موردنیاز علامت‌گذاری شده‌اند *