تکنیک SSCP

تکنیک SSCP

دکتر مهدی فصیحی رامندی (عضو هیئت علمی دانشگاه علوم پزشکی بقیه ا… (عج))

زهرا کریمی (مرکز تحقیقاتی زیست سلول پژوهان تدبیر)

دکتر رضا میرنژاد (دانشیار دانشگاه)

 

 

تکنیکSCCP[1]  برای اولین بار در سال ۱۹۸۹ توسط orita و همکارانش برای تعیین جهش‌ها و چند شکلی‌ها به‌کار رفت. عقیده بر این است که تعیین موتاسیون‌های نقطه‌ای توسط این تکنیک بر اساس تغییر در ساختار DNA تک‌رشته‌ای استوار می‌باشد. DNAهای تک‌رشته‌ای که دارای یک جهش ژنتیکی باشند نسبت به رشته‌های نرمال روی ژل پلی‌اکریلامید الگوی حرکتی متفاوتی از خود نشان می‌دهند (تمام انواع جهش‌های نقطه‌ای را می‌توان با این روش تشخیص داد). توالی بازهای کناری باز جهش‌یافته، بر روی قدرت تشخیص این تکنیک تأثیر می‌گذارد (شکل ۱). یکی از مشکلات این تکنیک این است که بر اساس نوع جهش، نمی‌توان الگوی حرکت DNA تک‌رشته‌ای را پیش‌بینی نمود. میزان توانایی این روش برای تعیین جهش‌ها در مجموع حدود ۷۰% است، ولی می‌توان آن را به ۹۵% هم رساند. بیشترین جاذبه این تکنیک در سادگی آن است. هنگامی که DNA تک‌رشته‌ای یا دو رشته‌ای روی یک ژل الکتروفورز می‌شوند، حرکت قطعه DNA وابسته به اندازه آن می‌باشد، اما حرکت DNA تک‌رشته‌ای علاوه بر اندازه، تابع شکل فضایی نیز هست که به علت پیوندهای هیدروژنی داخل زنجیره‌ای در DNA تک‌رشته‌ای است،‌ پس به علت این‌که DNA تک‌رشته‌ای نمی‌تواند به‌صورت یک خط صاف از ژل عبور کند، حرکت آن تابع اندازه و ساختار سوم (شکل فضایی) می‌باشد. اگر یک موتاسیون در یک رشته DNA وجود داشته باشد، بر روی این شکل فضایی تأثیر می‌گذارد. بر روی ژل SSCP علاوه بر DNA تک‌رشته‌ای DNA دو رشته‌ای نیز وجود دارد که به علت چسبیدن مجدد تک رشته‌ها ایجاد شده و سریع‌تر حرکت می‌کند.

SSCP

شکل ۱: نمای کلی از تکنیک SCCP

 

متغیرهای ژل SSCP

متأسفانه شکل فضایی یک قطعه DNA تک‌رشته‌ای تابع متغیرهای ژل نیز هست. حرکت یک قطعه DNA تک‌رشته‌ای نه تنها تابع شرایط ژل می‌باشد، بلکه بین ژل‌های مختلف نیز ممکن است کاملاً تکرارپذیر نباشد. یک سری از قطعات DNA که دارای یک توالی هستند، حرکت یکسانی دارند، ولی اگر جهشی در آنها رخ دهد حرکت آن رشته‌ها تفاوت می‌کند.

حساسیت SSCP وابسته به شرایط زیر است:

الف) دمای ژل: در این تکنیک دمای ژل اهمیت اساسی دارد؛ دمای بالا اثر دناتوره کننده دارد و باعث کاهش در میزان تشکیل ساختار سوم می‌شود و این مسئله سبب کاهش توانایی تکنیک در تعیین جهش‌ها می‌شود. معمولاً برای به حداکثر رساندن میزان تعیین جهش‌ها، بعضی از محققین نمونه‌ها را در دمای ۴ درجه سلسیوس الکتروفورز می‌کنند. پس بهتر است نمونه‌ها در یک اتاق با دمای ۴ درجه سلسیوس الکتروفورز شود. برای این منظور می‌توان از یک دستگاه خنک‌کننده ژل استفاده کرد.

 

ب) غلظت ماده Cross-linker و اکریلامید: ژل پلی‌اکریلامید از پلیمریزاسیون اکریلامید و یک ماده Cross-linker به‌وجود می‌آید که معمولاً N,N/-Methylene bis acrylamide است. اندازه منافذ ژل تحت تأثیر غلظت ژل (T%) و نیز میزان ماده Cross-linker‌ (C%) می‌باشد.

فرمول ۱ محاسبه غلظت ژل پلیاکریلامید:

فرمول ۲ محاسبه درصد ماده Cross-linker:

 

معمولاً برای SSCP، C% حدود ۲ و T% بین ۱۰-۶% بهترین نتیجه را می‌دهد، هم‌چنین معمولاً برای SSCP درصد اکریلامید بیشتر در حدود  ۶-۵% استفاده می‌شود، هرچند بعضی گروه‌های تحقیقاتی ژل‌های تا حدود ۱۰% را نیز به‌کار می‌برند.

 

ج) گلیسرول: معمولاً به ژل‌های SSCP گلیسرول اضافه می‌شود. نشان داده شده است که درصد گلیسرول بین۱۰-۵% توانایی SSCP را در تشخیص جهش‌ها بالا می‌برد. اثر گلیسرول را به‌علت داشتن گروه‌های –OH می‌دانند که باعث Relaxation قطعات DNA تک‌رشته‌ای می‌شود.

 

د) نوع ماتریکس ژل: ژل‌ (Mutation Detection Enhancement) MDE، یک ژل تجاری است که مزایایی را نسبت به ژل پلی‌اکریلامید معمولی در نشان دادن تغییرات حرکتی کوچک باندها دارا می‌باشد. این ژل بیشتر در Heteroduplex Analysis (HA) به‌کار می‌رود.

ه ) طول قطعه مورد بررسی: پارامتر کلیدی دیگر که بر میزان تعیین جهش‌ها توسط این تکنیک اثر می‌گذارد، طول قطعه اسید نوکلئیکی است که مورد ارزیابی قرار می‌گیرد. عموماً هر چه قطعه مورد نظر بزرگتر باشد، حساسیت این تکنیک پائین‌تر می‌آید، اما یک نقطه واضح و مشخص وجود ندارد، بلکه یک کاهش تدریجی در حساسیت تکنیک با افزایش طول قطعه DNA از bp250 به بالا وجود دارد. عموماً ۳۰۰ باز را حد بالای طول قطعه در نظر می‌گیرند، اما بعضی مقالات و مراجع تا bp450 را هم ذکر کرده‌اند. همچنین محل بروز موتاسیون نیز در حساسیت شناسایی آن مؤثر است. برای به‌دست آوردن طول قطعاتی که متناسب برای SSCP باشند، می‌توان به گونه‌ای طراحی کرد که قطعات حاصل از PCR را زیر bp300 به‌دست آورد یا اینکه ابتدا یک قطعه بزرگ را تکثیر کرده و سپس به‌وسیله هضم آنزیمی آن را به قطعات کوچک‌تر تقسیم نمود.

امروزه پیشرفت‌های زیادی در این تکنیک به عمل آمده است، به‌عنوان مثال از پرایمرهای نشاندار شده با فلوئورسین برای تکثیر استفاده شده و قطعات روی دستگاه Sequencer به‌طور اتوماتیک آنالیز می‌شوند. همچنین این تکنیک به‌صورت Multiplex در تعیین جهش‌های ژنتیکی در چندین ژن از جمله دیستروفین به کار رفته است.

این تکنیک در تعیین جهش‌ بسیاری از بیماری‌ها به کار رفته است، از جمله تعیین جهش‌های ژنتیکی در بیماری تی-ساکس، لوکوس ژن P53، ژن فیبروزیس سیستیک، ژن گیرنده انسولین، ژن گلوکوکیناز، ژنوم میتوکندری و هموفیلی B.

در مورد حساسیت این روش عقیده بر این است که برای یک قطعه ۲۰۰-۱۰۰ بازی بین ۹۵-۵۰% جهش‌ها را می‌توان به دست آورد و با شرایط مختلف این حساسیت ممکن است به ۱۰۰% برسد، ولی متأسفانه روشی برای پیش‌بینی این شرایط وجود ندارد. در جدول زیر مزایا و معایب این تکنیک آورده شده است:

 

جدول ۱: مزایا و معایب تکنیک SCCP

مزایا معایب
الف)‌ سادگی و کم بودن مراحل انجام آن

ب)تئوری پیچیده‌ای ندارد.

ج) به تجهیزات اختصاصی نیاز نیست.

د) می‌توان بدون نشاندار کردن آن را انجام داد.

الف) محل جهش ناشناخته باقی می‌ماند.

ب) محدودیت در اندازه قطعات مورد بررسی وجود دارد.

ج) به‌شدت وابسته به شرایط آزمایشگاهی است.

د) جهش‌ها ممکن است ناشناخته باقی بماند (به علت حساسیت محدود)

ه) گاهی تفسیر ژل‌ها مشکل می‌باشد.

 

روش کار تکنیک SCCP:

همانطور که در بالا اشاره شد این تکنیک یکی از ساده‌ترین تکنیک‌های غربالگری جهش بوده و به ابزار پیچیده‌ای نیاز ندارد. در این روش تحت شرایط ویژه‌ای اسید نوکلئیک تک‌رشته‌ای، ساختمان ثانویه‌ای را در محلول تشکیل می‌دهد. این ساختار ثانویه بستگی به ترکیب بافرها دارد و ممکن است با تغییر یک نوکلئوتید عوض شود و این مسئله باعث تفاوت در الگوی حرکت الکتروفورتیک قطعات در شرایط non denaturing روی ژل می‌شود. مشاهده شده است که ساختمان ثانویه توسط RNA بهتر از DNA تشکیل می‌شود. همچنین به‌وسیله RNA-SSCP قطعات بزرگ‌تری را می‌توان آنالیز کرد. برای تأیید جهش‌های شناسایی شده توسط SSCP باید تعیین توالی نیز انجام شود، زیرا چندشکلی‌ها هم می‌توانند سبب تغییرات حرکتی در SSCP شوند.

یکی از مشکلات بزرگ SSCP تجربی بودن آن است. مشکل دیگر اندازه قطعاتی است که بررسی می‌شوند که در حدود ۳۰۰-۲۰۰ باز، بهترین اندازه گزارش شده است. اگرچه این تکنیک سریع و ساده است، اما حساسیت این روش در دست افراد مختلف متفاوت بوده و مسائل دخیل در آن به‌خوبی شناخته نشده است. گروه‌های مختلفی بر روی پارامترهای مؤثر بر SSCP تحقیق کرده‌اند.

به‌طورکلی پارامترهای زیر می‌توانند بر روی الگوی جدا شدن تک‌رشته‌ها تأثیر بگذارند:

۱) حرارت

۲) افزودن‌ مواد دناتوره کننده به ژل (اوره- فرمامید)

۳) افزودن مواد خنثی (neutral)

۴) تغییر اندازه منافذ ژل

۵) غلظت اکریلامید

Glavac و Dean با مقایسه تغییرات حرکت در تعدادی از جهش‌ها روی ژل اکریلامید ۵% در غلظت C حدود ۲/۶% به نتایج جالبی رسیده‌اند؛ آن‌ها مشاهده کردند که رشته‌های غنی از بازهای پورینی دارای جهش، تغییرات حرکتی بیشتری را نسبت به رشته‌های غنی از پیریمیدین نشان می‌دهند. از سوی دیگر بر روی ژل ۷/۵% در همان غلظت ماده Cross-linker مشاهده کردند که تغییر حرکت بیشتر در رشته‌های غنی از پیریمیدین دیده می‌شوند. ازآنجایی‌که اندازه منافذ ژل تحت تأثیر غلظت اکریلامید و درصد ماده Cross-linker می‌باشد، به‌نظر می‌رسد که نه تنها اندازه منافذ، بلکه ساختمان ژل نیز روی حرکت DNAهای تک‌رشته‌ای تأثیر می‌گذارد. ممکن است استفاده از شیب اندازه منافذ مؤثر باشد.

افزودن ۱۰-۵% از ترکیبات خنثی به ژل اثرات متفاوتی روی الگوی حرکت رشته‌ها در SSCP دارد. بعضی از این مواد نظیر بوتانل ۱۰% اثری ندارند و بعضی نظیر اوره ۵% یا فرمامید ۵% اثر ناچیزی دارند، اما موادی مانند گلیسرول، گلوکز و سوکروز اثرات خوبی روی حرکت تک‌رشته‌ای‌ها دارند. این امر نشان‌دهنده این است که این ترکیبات با مکانیسم مشابهی روی ساختمان سنجاق‌سری در تک‌رشته‌ها اثر می‌گذارند. این اثر ممکن است به علت واکنش خفیف گروه‌های OH و یا تشکیل باندهای هیدروژنی داخل مولکولی باشد.

در حال حاضر نمی‌توان تغییر حرکتی را که به‌وسیله تغییرات در یک باز ایجاد می‌شود پیش‌بینی نمود. به نظر می‌رسد که در اکثر موارد بازهای مجاور محل جهش، اثر مهم‌تری روی تغییرات حرکتی DNA تک‌رشته‌ای داشته باشند. می‌توان از این مسئله این‌طور نتیجه‌گیری کرد که کارایی SSCP تا حد زیادی به توالی مورد آزمایش بستگی دارد و این میزان کارایی از یک قطعه DNA به قطعه دیگر متفاوت است.

عامل دیگر، اندازه قطعه DNA مورد نظر است که هر چه بزرگ‌تر باشد امکان این‌که یک تفاوت باز منجر به القاء تغییر ساختمان و تغییر حرکت روی ژل شود، کمتر می‌گردد.

درنهایت به‌نظر می‌رسد که مهم‌ترین متغیرهای مؤثر بر SSCP علاوه بر اندازه قطعه مورد بررسی، غلظت ژل و ماده Cross-linker می‌باشد. حساسیت این روش در ژل‌های با غلظت اکریلامید بین ۱۰-۸% و ماده Cross-linker بین ۲/۶-۱/۳% به حداکثر خود می‌رسد. تحت این شرایط می‌توان چندشکلی قطعات بین ۲۰۰-۱۲۰ باز را با حداکثر حساسیت به دست آورد. به نظر می‌رسد که یک ژل بهینه برای SSCP در شروع کار، اکریلامید ۸% با ماده Cross-linker 2% که در ۴ درجه سلسیوس الکتروفورز شود، می‌باشد.

درنهایت نکته‌ای که در مورد SSCP می‌توان گفت این است که با وجودی که SSCP یک تکنیک با تکنولوژی بالا نیست، اما همچنان شایع‌ترین روش برای بررسی جهش‌های ناشناخته می‌باشد.

 

تهیه ژل پلی‌اکریلامید:

مواد و دستگاه‌ها

  1. پلی اکریلامید/ بیس اکریلامید (۱/۳۹)
  2. TBE 10X
  3. گلیسرول
  4. آب دیونیزه
  5. آمونیم پرسولفات (APS) 10%(W/V)
  6. TEMED
  7. Bind Saline A174
  8. اسید استیک ۱۰%
  9. اتانول ۹۶%
  10. سیستم کامل الکتروفورز
  11. Circulator 230 VAC
  12. NaOH 0.5M

 

روش کار:

ابتدا شیشه‌های الکتروفورز را به مدت یک شب در NaOH 0.5M قرار داده و پس از شستشو با آب مقطر، با الکل ۹۶% تیمار می‌شوند. برای چسباندن ژل پلی‌اکریلامید به شیشه صاف زیرین، محلول زیر تهیه شود:

۱ میلی‌لیتر اتانول ۹۶%

lµ ۲۵۰ اسید استیک ۱۰%

lµ ۳/۵ Bind Saline

پس از مخلوط کردن، این محلول را روی شیشه صاف ریخته و در تمام قسمت‌های آن به‌طور کامل پخش کنید.

  1. پس از قرار دادن Spacerها روی شیشه زیرین، شیشه لبه‌دار را روی آن قرار داده و با Binder محکم کنید.
  2. ژل پلی‌اکریلامید را به‌صورت زیر آماده نمایید:

 

۲ml TBE 10X
۵-۱۰% Glycerol
۶-۱۰% Acr/Bis 39/1
lµ۴۰۰ APS 10%
lµ۴۰ TEMED

 

سپس آب دیونیزه اضافه شده تا حجم محلول به ۴۰ سی‌سی برسد.

پس از تهیه، ترکیب فوق را به‌آرامی بین دو لایه شیشه ریخته و شانه را قرار دهید. بعد از حدود یک ساعت ژل تشکیل می‌شود. پس از بستن ژل شیشه را بر روی تانک عمودی قرار داده و به مدت ۱۵ دقیقه برای رسیدن به تعادل حرارتی و الکتریکی pre run شود.

 

آماده‌سازی نمونه‌ها و الکتروفورز:

lµ۵ از محصول PCR را با lµ۱۲ از بافر بارگذاری SSCP مخلوط نموده و به مدت ۵ دقیقه در حرارت ۹۵ درجه سلسیوس قرار دهید. سپس به‌سرعت نمونه را به درون یخ منتقل نمایید.

ترکیب بافر بارگذاری عبارت است از: گزیلن، فرمامید ۹۵%، NaOH 1Mm، برومو فنل بلو %۰/۰۵ و سیانول %۰/۰۵

نمونه‌ها را درون چاهک‌های تعبیه شده بر روی ژل قرار دهید و با ولتاژ ۱۰۰۰-۸۰۰ و در حرارت ۴ درجه سلسیوس به مدت ۶ ساعت الکتروفورز نمایید.

 

رنگ‌آمیزی نیترات نقره:

برای ارزیابی ژل‌های پلی‌اکریلامید از رنگ نیترات نقره استفاده می‌شود. این روش معمولاً زمان‌بر می‌باشد. به همین دلیل از یک پروتکل ساده‌تر استفاده می‌شود.

 

مواد مورد نیاز رنگ‌آمیزی:

اسید نیتریک ۱۰%

نیترات نقره ۰/۲%(W/V)+ 0/5میلی‌لیتر فرمامید ۳۷% تازه

NaCO323% (W/V)+ 0/5 میلی‌لیتر فرمامید ۳۷%+۰/۵ میلی‌لیتر تیوسولفات ۲%

اسید استیک ۱۰%(محلول متوقف کننده)

 

روش رنگ‌آمیزی:

  1. پس از اتمام الکتروفورز دو شیشه را از هم باز نموده و شیشه حاوی ژل را در سینی قرار دهید و با آب دیونیزه شستشو دهید.
  2. به ژل اسید نیتریک ۱% افزوده و ۵ دقیقه به‌آرامی تکان دهید.
  3. اسید نیتریک را تخلیه و ژل را به مدت ۲ دقیقه با آب دیونیزه شستشو دهید.
  4. پس از تخلیه آب، محلول نیترات نقره را به ژل اضافه نموده و ۱۵ دقیقه در تاریکی تکان دهید (به‌منظور جلوگیری از اکسیداسیون و تیره شدن)
  5. ژل را با آب شستشو دهید.
  6. محلول حاوی NaCO3 را روی ژل ریخته و تا ظاهر شدن باند Shake نمایید.
  7. پس از ظاهر شدن باندها به ژل اسید استیک ۱۰% افزوده تا واکنش متوقف شود.
  8. درنهایت ژل را با آب مقطر شستشو داده و از آن عکس تهیه نمایید.

[۱] Single-strand conformation polymorphism

تکنیک‌های شناسایی جهش‌ها

انواع روش‌های شناسایی جهش‌ها

روش‌های شناسایی سریع عوامل میکروبی

برای دانلود پی دی اف برروی لینک زیر کلیک کنید

برچسبها
  • SSCP
  • دکتر رضا میرنژاد
  • دکتر مهدی فصیحی رامندی
  • زهرا کریمی

دیدگاهتان را بنویسید

نشانی ایمیل شما منتشر نخواهد شد. بخش‌های موردنیاز علامت‌گذاری شده‌اند *