تکنیک Invader

Invader

تکنیک Invader

دکتر مهدی فصیحی رامندی (عضو هیئت علمی دانشگاه علوم پزشکی بقیه ا… (عج))

زهرا کریمی (مرکز تحقیقاتی زیست سلول پژوهان تدبیر)

دکتر رضا میرنژاد (دانشیار دانشگاه)

 

تکنیک Invader assay یک روش مناسب تعیین ژنوتیپ برای بررسی DNA ژنومیک می‌باشد. علیرغم اینکه در این تکنیک الزامی به تکثیر قطعه موردنظر نیست (هرچند که می‌توان این قطعه را تکثیر نمود)، اما می‌توان از آن برای شناسایی تغییرات تک‌نوکلئوتیدی، حذف، اضافه، تعداد کپی‌های یک ژن، تشخیص عوامل عفونی و مطالعه بیان ژن از صحت بالایی استفاده کرد. این تکنیک بر روی DNA ژنومیک، RNA، محصول PCR و RT-PCR قابل انجام می‌باشد. در واکنش Invader، به‌جای تکثیر هدف، پیغام اختصاصی هدف تکثیر می‌شود. این تکنیک بر پایه توانایی آنزیم‌های برش‌دهنده[۱] در شناسایی و برش ساختارهای خاصی از اسید نوکلئیک مهاجم راه‌اندازی شده است. این ساختار خاص هنگامی به‌وجود می‌آید که دو اولیگونوکلئوتید[۲] (اولیگوی مهاجم[۳] و کاوشگر اولیه[۴]) که به هدف چسبیده‌اند، در قسمتی از ساختار خود بر روی هم قرار گیرند.

 

آنزیم Cleavage

این آنزیم‌ها یک مجموعه آنزیمی، شامل ‘۵ اندونوکلئازهای اختصاصی ساختار ترموفیل طبیعی و مهندسی‌شده می‌باشند. در Invader DNA assay از آنزیم‌های Cleavage به‌دست‌آمده از باکتری‌های ترموفیل مثل آرکی‌باکتر استفاده می‌شود. این آنزیم‌ها جزء خانواده اندونوکلئازی flap (FEN1) می‌باشند. قسمت اصلی این آنزیم‌ها مربوط به ناحیه ‘۵ اگزونوکلئازی آنزیم DNA پلی‌مراز I یوباکترهای ترموفیل می‌باشد.

 

ساختار اولیگونوکلئوتیدها

کاوشگر اولیه دارای دو بخش است؛ انتهای ‘۳ که اختصاصی هدف می‌باشد[۵] (TSR) و باله[۶] ‘۵٫ توالی باله ‘۵ مستقل از توالی هدف است. این باله دارای یک توالی عمومی برای شناسایی می‌باشد. در حضور هدف اختصاصی، انتهای ‘۳ اولیگومهاجم بر روی بخش متصل به هدف کاوشگر اولیه قرار می‌گیرد. این روی هم قرار گرفتن در موقعیت باز شماره ۱ رخ می‌دهد. اگر باز شماره ۱ کاوشگر اولیه مکمل هدف باشد، کاوشگر و اولیگومهاجم ساختار روی‌ هم[۷] را تشکیل می‌دهند. در این حالت آنزیم Cleavage انتهای ‘۳ کاوشگر اولیه را در موقعیت باز ۱ برش می‌دهد. در اینجا باله ‘۵ و انتهای ‘۳ TSR آزاد می‌شود. اگر باز موجود در ‘۳ مکمل هدف نباشد، به‌جای تشکیل ساختار Invader، یک ساختار شکاف‌دار تشکیل می‌شود. در نتیجه باز شماره ۱ کاوشگر اولیه، جزئی از ساختار بالۀ آزاد ‘۵ می‌شود. در این حالت آنزیم نمی‌تواند ساختار شکاف‌دار[۸] حاصل را شناسایی و برش دهد.

 

چرخه کاوشگر و تقویت پیغام

انتهای TSR کاوشگر طوری طراحی شده است که دمای ذوب آن نزدیک دمای انجام واکنش باشد. این امر موجب می‌شود که کاوشگر بریده‌شده با کاوشگر سالم به‌طور دائمی تعویض شوند. پس از برش آنزیمی قسمت باله و TSR از هدف جدا می‌شوند و یک کاوشگر سالم جدید جایگزین آن می‌گردد. ازآنجاکه کاوشگر اولیه به مقدار زیادی در دسترس است، تعداد زیادی از آن‌ها تحت واکنش برش آنزیمی ‌قرار می‌گیرند، در نتیجه مقدار زیادی از بالۀ بریده‌شده در محلول واکنش تجمع پیدا می‌کند. بالۀ آزاد به‌عنوان اولیگوی انتقال‌دهنده انرژی فلورسانس[۹] (FRET) عمل می‌کند. این باله در یک انتها فلوروفور و در انتهای دیگر محل برش آنزیم دارای رنگ خاموش‌کننده[۱۰] می‌باشد. آنزیم برش‌دهنده، فلوروفور را از خاموش‌کننده جدا می‌سازد و موجب ایجاد پیغام فلورسنت می‌شود. اگر از دو باله دارای توالی و رنگ فلوروفور متفاوت استفاده شود،‌ دو توالی مختلف در یک چاهک قابل شناسایی خواهد بود. محلول واکنش را به مدت ۴ ساعت در دمای ۶۳ درجه سانتیگراد انکوبه کرده و با استفاده از دستگاه Fluorescence plate reader، فلورسانس ساطع‌شده، اندازه‌گیری می‌شود. از روی میزان فلورسانس ساطع‌شده از نمونه طبیعی[۱۱] و نمونه جهش‌یافته نسبتی به دست می‌آید که با استفاده از این نسبت، هموزیگوت و هتروزیگوت بودن نمونه‌ها تعیین می‌شود. تعداد کپی‌های یک ژن از مقایسه آن ژن با یک ژن بیان‌شونده دائمی (خدمتکار) مثل βتوبولین به دست می‌آید (شکل ۱).

شکل ۱: تصویر شماتیک از تکنیک Invader

 

مدل DNA

در مدل DNA[12]، باله ‘۵، یک ساختار دورشته‌ای مهاجم موقتی را با اولیگو FRET به وجود می‌آورد. آنزیم Cleavage ساختار حاصل را شناخته و فلوروفور را از ‘۵ اولیگو FRET جدا می‌سازد، سپس باله از این ساختار جدا شده و می‌تواند مجدداً با اولیگو FRET سالم دیگری اتصال یافته و دوباره ساختار تهاجمی تشکیل دهد. برش خودبه‌خودی کاوشگر و اولیگو FRET در یک دمای ثابت که نزدیک دمای ذوب کاوشگر است، روی می‌دهد.

 

مدل RNA

آنزیم‌های Cleavase نوع FEN که در مدل DNA به کار می‌روند، اهدافی که از نوع RNA باشد را شناسایی نمی‌کنند، بنابراین در مدل RNA از آنزیم‌های مشتق از DNA پلی‌مراز استفاده می‌شود (نوع pol). آنزیم‌های نوع pol هم DNA و هم RNA را مورد شناسایی قرار می‌دهند. در این مدل دو قدم متوالی تحت عنوان واکنش اول و دوم وجود دارد؛ در واکنش اول کاوشگر و اولیگوی مهاجم، یک ساختار تهاجمی را روی RNA الگو تشکیل می‌دهند. یک اولیگوی اضافه دیگر تحت عنوان Stacker به انتهای ‘۳ کاوشگر چسبیده و باعث می‌شود که کاوشگر در دمای بالاتر نیز به هدف بچسبد. این امر حساسیت روش را افزایش می‌دهد. در واکنش دوم، محصول برش واکنش اول (باله ‘۵ و TSR) با الگوی واکنش دوم[۱۳] (SRT) و اولیگو FRET یک ساختار روی‌ هم را تشکیل می‌دهد. برش آنزیمی اولیگو FRET باعث می‌شود که فلوروفور از مولکول خاموش‌کننده جدا شده و پیغام فلورسانس آن ساطع شود. یک اولیگوی متوقف‌کننده[۱۴] به واکنش دوم اضافه شده و به TSR و قسمتی از باله ‘۵ متعلق به کاوشگر سالم متصل می‌شود. ازآنجاکه این متوقف‌کننده به کاوشگر سالم متصل شده، اما به بالۀ ‘۵ آزاد نمی‌چسبد، باعث ایجاد پیغام قوی‌تری می‌شود.

 

روش‌های فرعی آشکارسازی

ترکیب و توالی باله ‘۵، مستقل از هدف بوده و به روش‌های مختلفی (اندازۀ باله، توالی، شارژ و فلورسانس) قابل شناسایی می‌باشد. این خصوصیت به تکنیک Invader این توانایی را می‌دهد که از روش‌های فرعی متعددی برای تشخیص و آشکارسازی استفاده نماید (مثل Mass spectrometry، الکتروفورز لوله موئینه، Microfluidics، استفاده از آرایه تراشه‌ها[۱۵]، تسخیر[۱۶]، حسگر و فلورسانس)

شرکت ACLARA Biosciences مولکول‌های فلورسنت کوچک و قابل جداسازی با الکتروفورزی را تولید کرده است که به نام مولکول‌های گزارشگر eTag معروف شده‌اند. این مولکول‌ها به‌عنوان باله ‘۵ به کاوشگر اولیه متصل می‌شوند. eTag آزاد با استفاده از تجهیزات تعیین توالی DNA به روش استاندارد لوله موئینه، به‌صورت کمّی اندازه‌گیری می‌شود. با توسعه صدها نوع eTag، امکان انجام این تکنیک به‌صورت چندگانه[۱۷] به وجود آمده است. شرکت ACLARA  هم‌چنین نشان داد که امکان شناسایی ۲۶ آزمایش Invader با مدل RNA در یک لوله آزمایش وجود دارد.

 

اختصاصیت تکنیک Invader

این تکنیک ترکیبی از شناسایی توالی با تشخیص آنزیمی ساختار است، بنابراین اختصاصیت آن از دیگر روش‌ها بالاتر می‌باشد. این اختصاصیت از نوع ساختار تهاجمی آن حاصل می‌شود. اگر توالی محل برش کاملاً مکمل هدف نباشد، ساختار تهاجمی تشکیل نمی‌شود، در نتیجه بالۀ ‘۵، جهت شناسایی در واکنش دوم آزاد نمی‌شود. اختصاصیت بالا، قدرت تمایز و صحت روش را در تشخیص جهش‌ها، افزایش می‌دهد. با توجه به موارد فوق این تکنیک می‌تواند هر سه ژنوتیپ را به‌خوبی شناسایی و دسته‌بندی نماید. ازآنجاکه این تکنیک در آزمایشات کمّی نیز قابل استفاده است، از آن در شناسایی مستقیم کروموزوم و تعداد کپی‌های ژن از روی DNA ژنومی،‌ می‌توان استفاده کرد. بدین منظور می‌توان از یک ژن مرجع مثل βتوبولین (به‌شرط این‌که این ژن فاقد چندشکلی و حذف و اضافه باشد) استفاده کرده و پیغام فلورسانس حاصل از ژن مورد بررسی را با این ژن مرجع مقایسه نمود. در این حالت نتیجه بهتر و قابل‌قبول‌تری به‌دست می‌آید. طراحی اولیگو مهاجم باید به‌دقت صورت گیرد تا کمترین تشابه ممکن را با دیگر نقاط ژنوم داشته باشد. این طراحی دقیق موجب افزایش صحت اندازه‌گیری کمّی توالی هدف می‌شود.

این تکنیک با بسیاری از روش‌های آماده‌سازی نمونه و همچنین نمونه‌های مختلف از منابع متفاوت سازگار است. با استفاده از این تکنیک می‌توان نمونه‌های جانوری و گیاهی را با دقت بالایی تعیین ژنوتیپ نمود. همچنین روش‌های آماده‌سازی نمونه به‌صورت تجاری برای این تکنیک وجود دارد.

سهولت انجام کار، انعطاف‌پذیری و قابلیت کمّی شدن روش، از مزایای این تکنیک می‌باشد. این تکنیک در پلیت‌های میکروتیتر قابل انجام است. همچنین این تکنیک می‌تواند به‌صورت دستی، نیمه اتوماتیک و در شرایطی که حجم کار بالاست، به‌صورت اتوماتیک انجام شود.

 

کاربردهای تکنیک Invader

کاربرد این روش عبارت است از:

  • شناسایی جهش
  • تعیین ژنوتیپ در سطح وسیع
  • تشخیص و طبقه‌بندی بیماری‌های عفونی
  • شناسایی تراریخته و اندازه‌گیری کمّی آن
  • تعیین تعداد کپی‌های یک قطعه
  • آزمایش بیماری‌های ژنتیکی
  • مطالعه بیان ژن

 

[۱] Cleavage

[۲] Oligonucleotide

[۳] Invader oligonucleotide

[۴] Primary probe

[۵] ۳′ target-specific region

[۶] Flap

[۷] Overlapping structure

[۸] Nicked structure

[۹] Fluorescence resonance energy transfer

[۱۰] quencher

[۱۱] Wild type

[۱۲] DNA format

[۱۳] Secondary reaction template

[۱۴] Arrestor oligonucleotide

[۱۵] Array chips

[۱۶] Capture

[۱۷] Multiplex

تکنیک واکنش ‘‍‍۵ نوکلئاز

انواع روش‌های شناسایی جهش‌ها

تشخیص مولکولی بیماری‌های ارثی و استفاده از آن در تشخیص قبل از تولد و تشخیص پیش‌کاشتی استفاده از روش‌های نوین تعیین توالی

پیروسکوئنسینگ

برای دانلود فایل pdf  بر روی لینک زیر کلیک کنید

برچسبها
  • DNA
  • PCR
  • RT-PCR
  • تكنيك Invader
  • دکتر رضا میرنژاد
  • دکتر مهدی فصیحی رامندی
  • زهرا کریمی

دیدگاهتان را بنویسید

نشانی ایمیل شما منتشر نخواهد شد. بخش‌های موردنیاز علامت‌گذاری شده‌اند *