تشخیص آزمایشگاهی‌ مالاریا (Laboratory diagnosis of Malaria)

تشخیص آزمایشگاهی‌ مالاریا

تشخیص آزمایشگاهی‌ مالاریا

(Laboratory diagnosis of Malaria)

گردآوری و تألیف:

دکتر احمد مردانی

استادیار مؤسسه عالی آموزشی و پژوهشی طب انتقال خون

 

 

مقدمه

تشخیص بیماری مالاریا توسط پزشکان باتجربه بر اساس علائم و یافته­ های بالینی در مناطق اندمیک (endemic) امکان­پذیر می ­باشد، امّا درمان و معالجه بیماران مالاریایی بدون آزمایش خون جز در موارد اضطراری و عدم دسترسی به آزمایشگاه توصیه نمی­شود. بررسی‌های انجام‌شده در مناطق مالاریاخیز آفریقا نشان داد که در آزمایش میکروسکوپی نمونه خون حدود ۵۰ درصد از کودکانی که با توجه به علائم بالینی بیماری آن‌ها مالاریا تشخیص داده شده بود، انگل مالاریا مشاهده نشد. بایستی توجه داشت که علائم بالینی بسیاری از بیماری­ها از جمله عفونت‌های گوارشی و ادراری، تب­های ویروسی، سل، حصبه، تیفوس، مننژیت،تریپانوزومیازیس (Trypanosomiasis) و لیشمانیازیس احشایی (visceral leishmaniasis (VL)) یا کالاآزار (Kala-azar)  مشابه علائم بالینی مالاریا بوده و بایستی تشخیص افتراقی داده شوند [۲،۱].

 

تشخیص آزمایشگاهی مالاریا

برای تشخیص آزمایشگاهی مالاریا به‌طورمعمول از روش­های پارازیتولوژی (parasitological methods) و در موارد خاصی از سایر روش­ها استفاده می­کنند که به اختصار به شرح آن‌ها می­پردازیم (شکل ۱).

الف. روش­های پارازیتولوژی

۱: آزمایش میکروسکوپی نمونه خون از نظر انگل مالاریا

عملی­ترین، معتبرترین و باصرفه­ترین روش انتخابی تشخیص آزمایشگاهی بیماری مالاریا، تهیه گسترش­های خونی نازک و ضخیم (thick and thin blood smears)، رنگ­ آمیزی با یکی از روش­های رومانوفسکی Romanowsky به‌ویژه گیمسا (Giemsa) و جستجوی میکروسکوپی انگل توسط افراد آموزش­ دیده و ورزیده می­باشد. در این روش، نمونه خون موردنیاز برای تهیه گسترش­های نازک و ضخیم معمولاً از انتهای بند آخر انگشت میانی دست چپ بیمار و در نوزادان از انگشت شست دست و یا پا گرفته می­شود. برای این منظور نوک انگشت بیمار را با پنبه آغشته به الکل اتیلیک یا اتانول  Ethanol  ۷۰ درجه تمیز و گندزدایی (antisepsis) می­نمایند و پس از تبخیر شدن الکل، با نوک لانست (lancet)  سترون یا استریل (sterile) برآمدگی انتهای انگشت را با اعمال یک ضربه سریع و متناسب با ضخامت پوست بیمار سوراخ می­کنند. با فشار ملایم و آرام به قاعده انگشت قطره ­ای خون خارج می­شود که با استفاده از پنبه استریل و خشک آن را پاک می­نمایند. در صورت تکرار فشار، قطره خون دیگری در محل سوراخ شده نمایان می­شود که در این مرحله سطح تحتانی یک لام شیشه ­ای تمیز را با قطره خون خارج‌شده به‌گونه‌ای تماس می­دهند که قطره خون تقریباً در مرکز لام قرار گیرد. بلافاصله با تکرار فشار در سه مرتبه، سطح لام را با قطره ­های خون در سه نقطه نزدیک هم مابین قطره خون قرارگرفته در مرکز و لبه لام تماس دهید. در ادامه، با استفاده از لام تمیز دیگری قطره خون قرارگرفته در مرکز لام شیشه ­ای را با زاویه ۴۵ درجه با حرکت یکنواخت و نسبتاً سریع به‌طرف لبه لام به‌صورت شعله شمعی بگسترانید (گسترش نازک) و با یکی از گوشه­ های لام دوم، سه قطره خون نزدیک هم را با حرکت دورانی به شکل دایره در یک سطح محدودی تقریباً به‌اندازه یک دوریالی گسترش دهید (گسترش ضخیم). با مداد مشکی و نرم، مشخصات بیمار و تاریخ تهیه گسترش­های خونی را در قاعده گسترش خونی نازک یادداشت نمایید (شکل ۲).

 مالاریا

شکل ۱: نمایش شماتیک روش­های مختلف تشخیص آزمایشگاهی بیماری مالاریا [۳]

 مالاریا

شکل ۲: نمایش شماتیک طرز تهیه گسترش­های خونی نازک و ضخیم بر روی یک لام شیشه­ ای [۴]

 

گسترش­های نازک و ضخیم تهیه‌شده بایستی سریعاً با هوای سرد سشوار خشک شوند، چرا که قرار داشتن آن‌ها در معرض گردوغبار و حشرات سبب اختلال در تشخیص خواهد شد. پس از خشک شدن گسترش­ها، فقط گسترش نازک تهیه‌شده را با فروبردن قسمتی از لام دارای گسترش نازک در ظرف حاوی الکل متیلیک یا متانول Methanol  و خارج کردن آن تثبیت (fixation) می­نمایند. برای فیکسه کردن گسترش نازکی که به‌تنهایی بر روی یک لام تهیه‌شده باشد، کافی است با پیپت پاستور  (Pasteur pipette) و یا قطره­ چکان چند قطره متانول روی گسترش بریزید. برای رنگ­ آمیزی گسترش­ها به روش گیمسا، معمولاً رنگ گیمسای غلیظ (stock) را به نسبت سه تا پنج درصد با آب مقطر خنثی و یا آب بافر (buffer water) دارای ۷/۲-۷ pH: رقیق می­کنند. آب بافر  با حل کردن ۰/۷ گرم فسفات منوپتاسیک خشک (KH2PO4) و یک گرم فسفات دی­سدیک خشک (Na2HPO4) در یک لیتر آب مقطر خنثی تهیه می­شود. اگر pH آب بافر تهیه‌شده کمتر از ۷ و یا بیشتر از۷/۲باشد، با افـــزودن محلول­های فسفات دی­سدیک و یا فسفات منوپتاسیک دو درصد آن را تنظیم می­نمایند. پس از آماده کردن رنگ گیمسا، لام­های دارای گسترش را روی پُل رنگ­آمیزی (دو میله شیشه­ ای موازی که با فاصله پنج سانتی­متر روی یک تشتک قرار گرفته­ اند) قرار می­دهند و روی هر لام پنج سی­سی رنگ گیمسای آماده مصرف به‌گونه‌ای که تمام سطح لام را کاملاً بپوشاند، می­ریزند. اگر تعداد لام­ها زیاد باشد می­توان از ظرف شیاردار مخصوص رنگ­ آمیزی استفاده کرد.

مدت‌زمان رنگ ­آمیزی به روش گیمسا، ۴۵-۳۰ دقیقه می­باشد. پس از سپری شدن مدت‌زمان مذکور، لام­ها را با جریان ملایم آب شستشو داده و در ادامه آن‌ها را به‌طور مورب روی تخته شیاردار قرار می­دهند تا کاملاً خشک شوند. با توجه به ضخامت ۲۰ برابری گسترش ضخیم نسبت به گسترش نازک و افزایش شانس مشاهده انگل (۲۰ برابر)، بررسی میکروسکوپی انگل مالاریا معمولاً در گسترش­های ضخیم رنگ‌شده با استفاده از عدسی روغنی و بزرگ­نمایی تقریباً ۱۰۰۰ انجام می­گیرد. درصورتی‌که تعیین گونه انگل مالاریا در گسترش ضخیم مقدور نباشد،

می­توان از گسترش خونی نازک برای این منظور استفاده کرد [۱].

۲: روش­های تغلیظ انگل

این روش­ها در مواردی که تعداد انگل در خون کم باشد و با آزمایش میکروسکوپی گسترش خونی ضخیم انگلی دیده نشود، به کار می­روند. با توجه به خاصیت رنگ­ پذیری انگل­های مالاریا، در روشی موسوم به QBC (quantitative buffy coat) از یک ماده رنگی به نام اکریدین نارنجی (Acridineorange) برای دیدن مستقیم انگل مالاریا زیر میکروسکوپ استفاده می­شود. در این روش علاوه بر اکریدین نارنجی که در سطح داخلی لوله­ های باریک هپارینه اندود (coat) شده است، میکروسکوپ مجهز به اشعه ماورای بنفش، سانتریفیوژ میکروهماتوکریت و پلیت مخصوص برای قرار دادن لوله­ های خون سانتریفیوژ شده مورداستفاده قرار می­گیرند. در برخی موارد تشخیص گونه پلاسمودیوم (Plasmodium) و افتراق انگل مالاریا از عناصری که رنگ مذکور را به خود می­گیرند، مشکل می­باشد. روش QBC در تشخیص آزمایشگاهی بیماری مالاریا نسبت به گسترش خونی ضخیم حساس­تر و سریع­تر است [۵]. باوجوداین، نیاز به تجهیزات ویژه و گران­قیمت باعث شده که این روش جایگزین گسترش خونی ضخیم برای تشخیص بیماری مالاریا در فیلد و یا در کلینیک­ها نشود [۷-۵].

ب. روش­های تشخیصی ایمنی (immunodiagnostic methods)

۱: شناسایی و تعیین تیتر آنتی­بادی­های ضد مالاریایی

در بیماری مالاریا آنتی ­بادی­ها حدود یک هفته پس از ظهور انگل در خون محیطی با روش­های سرولوژی از جمله IFA،  IHAو ELISA قابل‌شناسایی می­باشند. تا زمانی که پارازیتمی (parasitemia) وجود دارد، تیتر آنتی ­بادی بالا است و با از بین رفتن انگل به هر دلیلی مثلاً در اثر درمان، تیتر آنتی ­بادی به‌تدریج کاهش می­یابد. بنابراین، کاربرد روش­های شناسایی آنتی ­بادی­های ضد مالاریایی در تشخیص مالاریا محدود می­باشد. این روش­ها در حاملان انگل در بین اهداکنندگان خون به‌منظور جلوگیری از مالاریای ناشی از انتقال خون
(transfusion-transmitted malaria (TTM)) در مناطق مالاریاخیز، افراد مشکوک به مالاریا از نظر بالینی و شواهد اپیدمیولوژیکی که در آزمایش میکروسکوپی نمونه خون آن‌ها انگل مالاریا مشاهده نشده است، بررسی­های سرواپیدمیولوژی و بررسی تغییرات انتقال بیماری در کانون­های مالاریاخیز کاربرد دارد [۸،۱]. آنتی­ ژن­های موردنیاز برای انجام این روش­ها را از انگل­های پلاسمودیوم فالسی­پاروم (Plasmodium falciparum) کشت‌شده، خون میمون­های خاص مانند میمون جغد (owl monkey) که می­توان آن‌ها را به پلاسمودیوم فالسی­پاروم آلوده کرد و همچنین خون بیمار مالاریایی مناسب تهیه می­کنند [۱].

۲: شناسایی آنتی­ ژن­های مالاریا با استفاده از منوکلنال آنتی ­بادی (monoclonal antibody)

برای تشخیص سریع (rapid) مالاریای انسانی، کیت­های مخصوصی به نام dipstick مورداستفاده قرار می­گیرد. در این کیت­ها برای شناسایی آنتی ­ژن­های خاص پلاسمودیوم ­ها مانند HRP-2 (histidine-rich protein-2) و LDH (lactate dehydrogenase) که به ترتیب برای تشخیص پلاسمودیوم فالسی­پاروم و تمامی پلاسمودیوم­ های انسانی به کار می­روند، از منوکلنال آنتی ­بادی (mAb) اختصاصی استفاده می­کنند. از مزایایی دیپ­استیـک­ها، زمان‌بر نبودن و همچنین کاربرد و تفسیر آسان آن‌ها می­باشد [۹،۵،۲]. ناتوانی در تشخیص نمونه­ های کم انگل، عدم تعیین مرحله انگلی و پاسخ­های مثبت کاذب از مهم‌ترین معایب روش­های تشخیصی سریع است [۵].

ج. روش­های مولکولی (molecular methods)

با وجود بالا بودن حساسیت (sensitivity) و ویژگی (specificity) روش­های مولکولی، استفاده از آن‌ها در مناطق مالاریاخیز با توجه به محدودیت­هایشان امکان­پذیر نمی­باشد. امروزه از روش­های مولکولی در مراکز تحقیقاتی برای تشخیص مالاریا، بررسی مقاومت­های دارویی، تعیین تنوع ژنتیکی و پلی­مورفیسم ژن­ها و آنتی­ژن­های کاندید واکسن و درمان مولکولی، بررسی­های اپیدمیولوژی و غیره استفاده می­کنند [۱۳،۱۲،۱۱،۱۰]. در جدول ۱ مقایسه مزایا و معایب روش­های مختلف تشخیص آزمایشگاهی بیماری مالاریا نشان داده شده است.

 

جدول ۱: مقایسه مزایا و معایب روش­های مختلف تشخیص آزمایشگاهی بیماری مالاریا [۳]

PCR Antigen detection QBC Light microscopy                           Method                        

Characteristic

pLDH HRP-2
++++ ++/+++ ++/+++ ++/+++ +++ Sensitivity
++++ none none ++/+++ +++ Expertise needed
++++ none none +++ +/++ Additional equipment
very slow fast fast moderate slow Time per test
+++ ++ ++ ++ not suitable Automation
not suitable ++/+++ ++/+++ ++/+++ +++ Individual diagnosis
++++ Pf &Pv Pf +/++ +++ Species identification
+++ ++(?) +/− +++ +++ Follow-up
no no no ++ +++ Parasite count
>3 ۳ ۵-۱۰ ۱٫۷-۴٫۰ ۰٫۰۳ Cost/test (US$)

 

منابع (References):

  1. ادریسیان غـلام­حسین، رضائیان مصطفی، قربانی مهـدی، کشاورز حســـــین، محب­علی مهـدی. تــک­ یاخته­ شناسی پزشکی. انتشارات دانشگاه علوم پزشکی تهران، چاپ اول، ۱۳۸۶٫
  2. WHO Expert of committee on malaria.2000. WHO Technical Report.Series 892.

۳٫Hanscheid T. Diagnosis of malaria: a review of alternatives to conventional microscopy. Clin Lab Haem 1999; 21:235-245.

  1. http://www.shoklo-unit.com/lab.shoklo-unit.com/labman/labman_e.html#40

۵٫Schindler HC, Montenegro L, Montenegro R, CarvalhoAB, Abath FG, Jaureguiberry G. Development and optimization of polymerase chain reaction-based malaria diagnostic methods and their comparison with quantitative buffy coat assay. Am J Trop Med Hyg 2001; 65:355-361.

۶٫Makler MT, Palmer CJ, Ager AL. A review of practical techniques for the diagnosis of malaria. Ann Trop Med Parasit 1998; 92:419-433.

۷٫Bush OA, Fernández CJ, Esch WG, Richard Seed J. 2001. Parasitism: The Diversity and Ecology of Animal Parasites, 1th ed.CambridgeUniversity Press.

۸٫Warrel DA, Gilles HM. 2002. Essential Malariology, 4th ed. Oxford University Press Inc, Oxford, UK.

  1. Moody A. Rapid diagnostic tests for malaria parasite. ClinMicrobiol Rev 2002; 15:66-78.

۱۰٫Zakeri S, Afsharpad M, Raeisi A, Djadid DN. Prevalence of mutations associated with antimalarial drugs in Plasmodium falciparum isolates prior to the introduction of sulphadoxine-pyrimethamine as first-line treatment in Iran. Malar J 2007; 6:148.

۱۱٫Heidari A, Dittrich S, Jelink T, Kheirandish A, Banihashemi K, Keshavarz H. Genotypes and in vivo resistance of Plasmodium falciparum isolates in an endemic region of Iran. Parasitol Res 2006; 100:589-592.

۱۲٫Mardani A, Keshavarz H, Heidari A, Hajjaran H, Raeisi A, Khorramizadeh MR. Genetic polymorphism at the C-terminal domain (region III) of knob-associated histidine-rich protein (KAHRP) of Plasmodium falciparum in isolates from Iran. Parasitol Res 2011; 109:1647–۱۶۵۲٫

۱۳٫Mardani A, Keshavarz H, Heidari A, Hajjaran H, Raeisi A, Khorramizadeh MR. Genetic diversity and natural selection at the domain I of apical membrane antigen-1 (AMA-1) of Plasmodium falciparum in isolates from Iran. Exp Parasitol 2012; 130:456-462.

مروری کوتاه بر روش‌های تشخیص آزمایشگاهی عفونت مالاریا

نگاهی اجمالی بر روش‌های تشخیص آزمایشگاهی مالاریا

تاریخچه مالاریا (malaria)

تست‌های تشخیصی سریع بیماری مالاریا

واکسن مالاریا (Malaria Vaccine)

برای دانلود پی دی اف بر روی لینک زیر کلیک کنید

برچسبها
  • پارازیتولوژی
  • تغلیظ
  • دکتر احمد مردانی
  • مالاریا

دیدگاهتان را بنویسید

نشانی ایمیل شما منتشر نخواهد شد. بخش‌های موردنیاز علامت‌گذاری شده‌اند *