اصول فنی تجهیزات آزمایشگاهی (۵)

اصول الایزا

اصول فنی تجهیزات آزمایشگاهی

قسمت پنجم

اصول الایزا

مهندس احسان درخشان‌نیا

derakhshannia@hotmail.com

 

ELISA یک روش آزمایشگاهی بیوشیمیایی ساده با حساسیت بسیار بالا است که امکان آنالیز تعداد زیادی نمونه را به‌صورت همزمان فراهم می‌کند. این روش در ایمونولوژی (ایمنی‌شناسی) برای تشخیص وجود یک آنتی‌بادی یا آنتی‌ژن در نمونه مورد آزمایش استفاده می‌شود که عموماً به‌عنوان ابزاری تشخیصی در پزشکی و پاتولوژی و همچنین تست کنترل کیفیت در بسیاری از صنایع کاربرد دارد. این آزمایش به منظور پی بردن به آنتی‌ژن ناشی از ارگانی عفونی در بدن یا مواد غیرنرمالی که معرف برخی بیماری‌هاست انجام می‌شود. همچنین آنتی‌بادی‌هایی که در پاسخ به برخی عفونت‌ها یا بیماری‌ها به جود آمده نیز توسط این آزمایش قابل تشخیص هستند.

پیش از ایجاد روش الایزا تنها گزینه برای انجام سنجش ایمنی و سنجش‌های ایمونوشیمی، روش Radioimmunoassay بود، تکنیکی که در آن از آنتی‌ژن یا آنتی‌بادی نشان‌دار شده با مواد رادیواکتیو استفاده می‌شود. در این روش، ماده رادیواکتیو، سیگنال تولید می‌کند که نشان می‌دهد آنتی‌ژن یا آنتی‌بادی خاص در نمونه وجود دارد یا نه؛ اما ازآنجایی‌که رادیواکتیویته تهدیدی برای سلامتی محسوب می‌شود به دنبال جایگزین ایمن‌تری برای آن بودند که به‌جای سیگنال رادیواکتیو، سیگنالی غیررادیواکتیو تولید کند. دو محقق به نام‌های Stratis Avrameas و G.B.Pierce مشاهده نمودند که زمانی که آنزیمی مثل پراکسیداز (Peroxidase) با سوبسترای مناسب واکنش می‌دهد، تغییر رنگی روی می‌دهد که از آن می‌توان به‌عنوان سیگنالی برای تعیین وجود آنتی‌بادی یا آنتی‌ژن استفاده نمود. سرانجام در سال ۱۹۷۱ دو دانشمند سوئدی به نام‌های Peter Perlmann و EvaEngvall به روش الایزا به شیوه‌ی امروزی پی بردند.

مزایای استفاده از روش الایزا نسبت به روش‌های رادیواکتیو به قرار زیر است:

  • نداشتن خطرات مواد رادیواکتیوی
  • طولانی بودن نیم‌عمر فعالیت آنزیم‌ها نسبت به مواد رادیواکتیو
  • ارزان بودن تجهیزات و دستگاه‌های الایزا نسبت به دستگاه سنجش مواد رادیواکتیو
  • آماده‌سازی آسان آزمایش الایزا و بی‌خطر بودن دفع ضایعات آن نسبت به مواد رادیواکتیو

و معایب این روش:

بدیهی است که هر روشی از نقاط ضعف و قوت خاص خود برخوردار است. ایرادهایی به سیستم آنزیمی وارد است که مهم‌ترین آن مربوط به شرایط نگهداری کیت‌ها و عدم آلودگی‌ آنها می‌باشد.

برای شرح روش الایزا ابتدا نیاز به آشنایی با اصطلاحات زیر است:

  • آنتی‌ژن: آنتی‌ژن ماده‌ای است که قادر است پاسخ ایمنی بدن را تحریک کند. پروتئین‌ها و گلیکوپروتنین‌ها (Glycoprotein) بهترین نمونه آنتی‌ژن‌ها هستند.
  • آنتی‌بادی: آنتی‌بادی‌ها ساختمانی خاص دارند و در ساده‌ترین حالت به شکل یک مولکول، با سه بازو دیده می‌شوند. این مولکول را می‌توان به شکل Y در نظر گرفت. پایه Y در برقراری ارتباط آنتی‌بادی با سلول‌های سیستم ایمنی ایفای نقش می‌کند (FC). دو بازوی دیگر این مولکول دقیقاً به هم شبیه بوده و بخش انتهایی برای هر آنتی‌ژن اختصاصی است. این قسمت که قادر است به یک دترمینانت آنتی‌ژنیک متصل شود، قطعه آنتی‌بادی و یا Fab نامیده می‌شود و به‌صورت کاملاً اختصاصی به اپی‌توپ‌های مشابهی بر سطح یک آنتی‌ژن یا دو آنتی‌ژن مشابه کنار هم می‌چسبد.

به‌طور معمول بر روی هر آنتی‌ژن، اپی‌توپ‌های متعددی وجود دارد، لذا علیه هر آنتی‌ژن، معمولاً تعداد زیادی آنتی‌بادی تولید می‌شوند که هرکدام مختص یک نوع اپی‌توپ‌ است (شکل ۱).

اصول الایزا

شکل ۱. اتصال آنتی‌بادی‌های مختلف تولیدشده علیه یک آنتی‌ژن به اپی‌توپ‌های مربوط به آن

ذکر این نکته حائز اهمیت است که مثلاً در پی ورود میکروب‌ها به بدن، آنتی‌بادی ضد آنها تولید می‌شود، لذا یافتن آنتی‌ژن میکروب یا حتی آنتی‌بادی ضد این آنتی‌ژن، نشانگر حضور فعلی یا حضور قبلی میکروب در بدن است. میزان آنتی‌بادی‌ها در مراحل مختلف بیماری کم یا زیاد می‌‌شود، لذا مقدار آنتی‌بادی یا آنتی‌ژن نیز بسیار حائز اهمیت است. هنگامی که یک محلول حاوی آنتی‌ژن با محلول حاوی مقدار مناسب آنتی‌بادی مخلوط می‌شود، اغلب کمپلکس آنتی‌ژن آنتی‌بادی رسوب می‌کند و یک توده نامحلول تشکیل می‌شود. اگر یک آنتی‌ژن به‌صورت جامد باشد، مانند یک سلول در قسمتی از یک بافت، این آنتی‌ژن می‌تواند با آنتی‌بادی در یک محلول متصل می‌شود.

 

دستگاه الایزا

دستگاه الایزا درواقع شبیه دستگاه فتومتر می‌باشد، با این تفاوت که نوع کووِت (Cuvette) یا همان ظرف محتوی نمونه، مسیر خوانش و تعداد فیلترها تغییر نموده است، به‌عنوان مثال به‌جای کووِت از چاهک یا Well استفاده شده و مسیر خوانش آن نیز برخلاف تکنیک‌های فتومتری، به‌صورت عمودی می‌باشد. همچنین با توجه به اینکه در تکنیک الایزا از آنزیم‌ها و سوبستراهای مشخصی استفاده می‌شود، لذا دارای فیلترهای کمتری نسبت به فتومترها می‌باشد.

 

تجهیزات لازم برای انجام آزمایش الایزا

در آزمایشگاه‌های پزشکی برای انجام آزمایشات سنجش ایمنی به روش الایزا امکانات زیر موردنیاز است:

  1. میکروپلیت ریدر
  2. میکروپلیت واشر
  3. سمپلر و عوامل پیپت کردن
  4. انکوباتور برای انکوبه کردن پلیت‌ها
  5. کیت الایزا

کیت الایزا خود متشکل از موارد زیر است:

  • یک یا دو عدد پلیت ۹۶ خانه‌ای که در ۱۲ ستون ۸ خانه‌ای قرار گرفته‌اند همانطور که در شکل ۲ مشخص است. هر یک از خانه‌ها را چاهک و هر ستون ۸ خانه‌ای را یک استریپ می‌گویند. جنس چاهک‌ها از پلی‌استیرن، پلی‌وینیل کلراید و یا پلی‌پروپیلن بوده و عمقی حدود یک سانتیمتر داشته و به اشکال ته‌صاف و یا ته‌گرد موجود می‌باشند. چاهک‌های ته‌صاف برای قرائت اسپکتروفتومتری در سنجش‌هایی که افزایش رنگ دارند مناسب بوده و چاهک‌های ته‌گرد برای این امر مناسب نمی‌باشند.

اصول الایزا

شکل ۲. ۹۶-Well Plates

  • ویال‌های استاندارد کنترل منفی و مثبت: این ویال‌ها با توجه به نوع کیت می‌توانند به‌صورت محلول یا لیوفیلیزه باشند.
  • رقیق‌کننده نمونه: مزیت رقیق‌کننده در این است که با توجه به رقیق‌سازی نمونه، اثر هوک را تا حدود زیادی خنثی می‌نماید. منظور از اثر هوک، کسب نتایج منفیِ کاذب به علت غلظت بالای آنالیت (Analyte ) می‌باشد.
  • کونژوگه نشان‌دارشده با آنزیم: مهم‌ترین آنزیم‌های مورد استفاده در الایزا شامل: پراکسیداز، آلکالن فسفاتاز و پنی‌سیلیناز می‌باشند ولی عمدتاً از پراکسیداز استفاده می‌شود. آلکالن فسفاتاز به دلیل قیمت بالایی که نسبت به پراکسیداز دارد بیشتر در کارهای تحقیقاتی استفاده می‌شود. لازم به ذکر است نقش آنزیم مورد استفاده برای نشان‌دارسازی، در تعیین نوع سوبسترا و نوع محلول متوقف کننده بسیار مهم است.
  • محلول شستشو: این محلول متشکل از بافر فسفات سالین phosphate buffer salin،
    ۲۰ Tween، و تایمرسال thimerosal می‌باشد. هرچند بافر فسفات سالین با تنظیم قدرت یونی و pH مناسب، اتصال غیراختصاصی به جداره چاهک را به حداقل می‌رساند، برای افزایش دقت و کاهش بیشتر اتصالات غیراختصاصی از مقدار کمی پروتئین و دترجنت مانند تواین ۲۰ استفاده می‌شود. ازآنجایی‌که محیط‌های بافری غالباً برای رشد میکروارگانیسم‌ها بسیار مناسب می‌باشند، لذا از ترکیبات نگهدارنده نظیر تایمرسال استفاده می‌شود.
  • محلول سوبسترا-کروموژن: این محلول به‌صورت جداگانه یا به‌صورت ترکیبی موجود می‌باشد. سوبسترا بر اساس حلالیت می‌تواند محلول یا غیرمحلول باشد اما سوبسترای مصرفی در آزمایش الایزا بایستی محلول باشد. نوع سوبسترا بستگی به کونژوگه آنزیمی دارد، یعنی اگر کونژوگه آنزیمی پراکسیداز باشد، سوبسترا می‌تواند تترامتیل بنزیدین (Tetra Methyl Benzidine) و یا ارتوفنل دی‌آمین (Ortho phenylenediamine) باشد و رنگ حاصل از واکنش آبی خواهد بود. اگر کونـــــــژوگه آنزیمی آلکالــــــن فسفاتاز باشد، سوبســـترا می‌تواند پارانیتروفنل (Para NitroPhenol) باشد و رنگ حاصل از واکنش زرد خواهد بود.
  • محلول متوقف کننده یا بلوکر (Stopping or Blocking Solution): این محلول با توجه به نوع کونژوگه آنزیمی می‌تواند اسیدی یا قلیایی باشد. هنگامی که کونژوگه آنزیم پراکسیداز باشد، برای توقف واکنش می‌بایست از محلول‌های اسیدی نظیر اسید کلریدریک و یا اسید سولفوریک استفاده نمود. در این صورت رنگ آبی واکنش تبدیل به زرد می‌شود و اگر کونژوگه آلکالن فسفاتاز باشد برای توقف واکنش از محلول‌های قلیایی نظیر هیدروکسید سدیم، NaOH استفاده می‌شود که در این حالت رنگ زرد واکنش به رنگ قهوه‌ای تبدیل خواهد شد.

 

چگونگی انجام آزمایش الایزا

پایه اساسی آزمایش الایزا واکنش آنتی‌بادی با آنتی‌ژن می‌باشد. در روش الایزا آنتی‌بادی اختصاصی با یک آنتی‌ژن مشخص واکنش می‌دهد و سپس به آن، یک آنتی‌بادی اتصال یافته با یک آنزیم به‌عنوان سیستم نشانگر اضافه می‌شود. در ادامه با افزودن سوبسترای آنزیم آن را تبدیل به یک محصول که یک ماده رنگی می‌باشد نموده و توسط دستگاه قرائت می‌کنیم. طول‌موج رنگ به‌دست‌آمده که نشان‌دهنده وجود یک آنتی‌بادی (و یا آنتی‌ژن) و نیز غلظت آن می‌باشد توسط دستگاه الایزا ریدر یا خوانشگر الایزا (فتومتر) قرائت شده و ثبت می‌گردد. لازم به ذکر است که آنتی‌بادی اختصاصی هر آنتی‌ژنی می‌بایست با روش‌های خاصی تولید شوند. برای نمونه، برای به دست آوردن آنتی‌بادی هر یک از ویروس‌های مشکوک به عامل بیماری‌زا می‌بایست آن ویروس را خالص‌سازی کرد و برای این کار با تزریق ویروس به حیواناتی چون موش، بز و اسب آنتی‌بادی‌ای را که این حیوانات علیه آنتی‌ژن تزریقی می‌سازند، به کمک سانتریفیوژ استخراج نمود.

 

مراحل یک آزمون الایزا

مراحل انجام یک آزمون الایزا به‌صورت زیر است:

  1. جذب یک آنتی‌ژن یا آنتی‌بادی به سطوح جامد پلاستیکی که اصطلاحاً پوشش‌دهی نامیده می‌شود.
  2. افزودن نمونه‌های مورد آزمایش
  3. انکوباسیون واکنش‌گرها برای در اختیار قرار دادن مدت زمان کافی برای انجام واکنش
  4. جدا نمودن واکنش‌گرهای متصل‌شده و واکنش‌داده از واکنش‌گرهای آزاد و متصل‌نشده با استفاده از عمل شستشو
  5. افزودن عوامل متصل‌شده با آنزیم
  6. انکوباسیون واکنش‌گرها برای دراختیار قرار دادن مدت زمان کافی برای انجام واکنش
  7. جدا نمودن واکنش‌گرهای متصل‌شده و واکنش‌داده از واکنشگرهای آزاد و متصل نشده با استفاده از عمل شستشو
  8. افزودن سوبسترای آنزیم جهت تشخیص واکنش‌دهنده‌ها
  9. انکوباسیون واکنش‌گرها برای دراختیار قرار دادن مدت زمان کافی برای انجام واکنش
  10. خاتمه دادن واکنش آنزیمی توسط متوقف‌کننده‌ها و قرائت دانسیته‌ی نوری بدست‌آمده توسط دستگاه اسپکتروفتومتر

 

فاز جامد الایزا

امروزه بیشتر از پلیت‌های ۹۶ خانه‌ای به‌عنوان فاز جامد استفاده می‌شود. انواع انعطاف‌پذیر و جداشدنی از پلی‌وینیل کراید و انواع سخت و محکم از پلی‌استیرن ساخته می‌شوند. هم‌اکنون شرکت‌های معتبر و متعددی به ساخت انواع مختلف پلیت‌های الایزا مشغول هستند. در برخی از انواع این پلیت‌ها، کف چاهک‌ها صاف و تخت بوده و بعضی دیگر مقعر می‌باشند.

بعضی از پلیت‌ها دارای خاصیت چسبندگی بالا بوده و بعضی دارای چسبندگی متوسط می‌باشند. امروزه آزمایش‌های متعددی با موفقیت با هرکدام از این نوع پلیت‌ها انجام می‌شود و نمی‌توان گفت که قطعاً کدام نوع پلیت برتری بر دیگر انواع پلیت‌ها دارد. می‌توان با انجام دو آزمایش الایزای کاملاً یکسان که تنها در نوع پلیت متفاوت هستند و بررسی نتایج تشخیص داد که برای کدام نوع از آنتی‌ژن، کدام پلیت بهتر است. به‌طور کلی پلیت‌هایی که انتهای چاهک‌های آنها تخت می‌باشد، توصیه می‌شود.

 

پوشش‌دهی در الایزا

این مرحله که یکی از مهم‌ترین مراحل آزمون الایزا می‌باشد، عبارت است از اتصال پروتئین آنتی‌ژن یا آنتی‌بادی بر روی پلیت، درون چاهک‌های یک پلیت ۹۶ خانه‌ای که عمدتاً بر اساس واکنش‌های آب‌گریز مابین ماتریکس پلاستیکی و پروتئین می‌باشد، بنابراین هر پروتئین یک ثابت اتصال متفاوتی با پلیت‌ها دارد. این واکنش بستگی به بار خالص پروتئین ندارد. عمل پوشش‌دهی به عواملی مثل مدت زمان پوشش‌دهی، دما، غلظت پروتئین‌هایی که باید پوشش داده شوند، نسبت سطح چاهک‌ها به حجم محلول پوشش‌دهی و ضریب انتشار مولکول‌های پروتئینی درون محلول پوشش‌دهی درون چاهک‌ها بستگی دارد.

عوامل فوق یکپارچه بوده و جدای از یکدیگر نیستند. یکی از مهم‌ترین موارد، بدست آوردن غلظت مناسب از پروتئین برای اتصال مناسب به پلیت می‌باشد که از طریق تیتراسیون پروتئین به‌دست می‌آید.

غلظت یک پروتئین جهت پوشش‌دهی، وابسته به فعالیت آن پروتئین می‌باشد. مشخص است که یک محلول پروتئینی که دارای مقدار کمی از پروتئین موردنظر باشد، مقدار اتصال آن پروتئین به پلیت بر طبق نسبت حضور آن پروتئین در محلول کم می‌باشد و ناخالصی‌های موجود در محلول پروتئینی سطوحی را که باید پروتئین موردنظر در اختیار داشته باشد، اشغال می‌نمایند که در نهایت منجر به یک اندازه‌گیری ضعیف می‌شود.

با استفاده از چند تست الایزا که در آنها غلظت پروتئین موردنظر برای پوشش‌دهی متفاوت است می‌توان به یک غلظت مناسب از پروتئین جهت پوشش دادن دست یافت. توجه به این مطلب مهم است که دانسیته اتصال پروتئین به پلیت در نتیجه نهایی اهمیت دارد. اتصال با دانسیته بالا حتی ممکن است برخلاف انتظار به نتایج ضعیف منجر شود، چراکه این دانسیته بالا می‌تواند از لحاظ فضایی اجازه نزدیک شدن پروتئین دوم (آنتی‌ژن یا آنتی‌بادی) را به پروتئین پوشش داده‌شده ندهد. در حقیقت مولکول‌های پروتئین پوشش داده‌شده، آن‌قدر با شدت و استحکام بالا (و بینابین یکدیگر) به سطح چاهک متصل شده‌اند که حتی جایگاه‌های اتصالشان در دسترس اتصال به پروتئین دوم (فرضاً آنتی‌بادی) نمی‌باشد.

غلظت‌های زیاد پروتئینی که باید پوشش داده شود، نیز منجر به همین مسئله می‌شود. رابطه غلظت یک آنتی‌ژن یا آنتی‌بادی با چگالی نوری (optical density) به‌دست‌آمده در مرحله نهایی تست الایزا یک رابطه خطی صرف نیست و برای هر پروتئینی بسته به شکل فضایی آن پروتئین و نیز در هر محدوده میزان هیدروفوبیسیته (hydrophobicity) واکنش پروتئین- پلیت وابسته به دما نیز هست. افزایش دما موجب افزایش این هیدروفوبیسیته می‌شود و این افزایش منجر به اتصال مستحکم‌تر پروتئین به پلیت می‌گردد. یکی از رایج‌ترین روش‌های پوشش‌دهی از لحاظ دما، در مجاورت قرار دادن پلیت با پروتئین در دمای ۳۷ درجه سانتی‌گراد می‌باشد که در این دما بین ۱ تا ۳ ساعت زمان مناسبی برای اغلب پروتئین‌ها می‌باشد. در مرتبه بعد می‌توان روش پوشش‌دهی در طول شب در ۴ درجه و یا ترکیبی از این دو را به‌کار گرفت.

البته مشخص است که افزایش دما در مدت زمان طولانی ممکن است باعث تغییراتی در ساختار پروتئین موردنظر جهت اتصال به پلیت شود. تکان دادن یکنواخت، آرام و منظم پلیت نیز می‌تواند با افزایش میزان برخورد و درنتیجه اتصال پروتئین به پلیت، زمان موردنظر برای پوشش‌دهی را کاهش دهد.

 

بافر پوشش‌دهی

از لحاظ تئوری بهترین بافری که مورد استفاده قرار می‌گیرد، بافری است که دارای pH برابر با ۱ تا ۲ واحد بالاتر از PH پروتئین اتصالی باشد؛ اما در عمل اندازه‌گیری آن آسان نیست چراکه پروتئین اتصالی (فرضاً آنتی‌ژن) حاوی مخلوطی از پپتیدهای متفاوت است. با انجام چند آزمایش الایزا که دارای pH متفاوت باشند و قدرت یونی متفاوتی در بافر پوشش‌دهی داشته باشند، می‌توان اتصال بهتر و مناسب‌تر پروتئین به پلیت را به دست آورد. پروتئین‌های با خاصیت اسیدی، احتیاج به یک pH پائین‌تر جهت خنثی نمودن نیروی دافعه بین پروتئین و پلیت دارند. گاهی اوقات بعضی از آنتی‌ژن‌ها مشکلاتی را در پوشش‌‌دهی بوجود می‌آورند؛ این آنتی‌ژن‌ها شامل پلی‌ساکاریدها، لیپوپلی‌ساکاریدها و گلیکولیپیدها هستند که پوشش‌‌دهی مستقیم را منجر به نتایج ضعیف و نامناسب می‌نمایند. در این‌گونه موارد یک پوشش‌‌دهی ابتدایی موردنیاز است که با یک آنتی‌‌سرم اختصاصی انجام می‌شود که یک حالت ساندویچی را بوجود می‌آورد، بنابراین مخلوط تخلیص‌نشده آنتی‌‌ژن‌ها، مناسب برای پوشش‌دهی مستقیم نیست و در صورت نیاز از الایزای ساندویچی استفاده می‌شود.

به دلیل ماهیت غیرکووالانسی اتصالی پروتئین به پلیت، جدا شدن یک پروتئین از پلیت نیز ممکن است رخ دهد، اما اگر شرایط پایدار و استاندارد باشد، تأثیر مهمی در یک آزمون الایزا نخواهد گذاشت. انواع روش‌های مختلف الایزا عبارتند از ساندویچی، رقابتی و غیررقابتی که در ادامه به آن می‌پردازیم.

 

روش‌های انجام آزمایش الایزا

از جمله آزمایش‌هایی که به روش الایزا انجام می‌شود می‌توان به آزمایش‌های مربوط به سنجش آنتی‌بادی‌های HIV-Ab، Anti-DNA، ANA، Listeria-Ab، TORCH[1]، تست‌های هورمونی از قبیل BHCG، FSH، LA پرولاکتین، T4،  TSH،T3، آنتی‌بادی و آنتی‌ژن‌های هپاتیتی HBs-Ag، HBs-Ab، Hbe-Ab، Hbe-Ag، HAV-Ab،HCV-Ab  و HBc-Ab اشاره نمود.

تست الایزا بر اساس شیوه شناسایی و تشخیص به روش‌های زیر انجام می‌شود که عبارتند از:

  1. روش مستقیم
  2. روش غیرمستقیم
  3. روش ساندویچ
  4. روش رقابتی یا مهاری

در ادامه به شرح مختصری ازاین‌روش‌ها می‌پردازیم.

 

  • الایزای مستقیم

در این روش آنتی‌ژن یا آنتی‌بادی موجود در نمونه که باید تشخیص داده شود به‌طور مستقیم بر سطح فاز جامد کوت (Coat) یا پوشانده می‌شود و سپس آنتی‌بادی یا آنتی‌ژن مکمل آن که نشان‌دار شده است به سیستم اضافه می‌شود. در صورت وجود آنتی‌ژن یا آنتی‌بادی موردنظر در نمونه، سیگنال مناسب ایجاد می‌شود. این روش کاربرد چندانی در کیت‌های تشخیصی ندارد و بیشتر در کارهای تحقیقاتی استفاده می‌شود.

 

  • الایزای غیرمستقیم

این روش برای تعیین آنتی‌بادی اختصاصی و یا تیتراسیون آنتی‌بادی در نمونه‌های سرم مورد استفاده قرار می‌گیرد. اساس آزمایش بدین‌صورت است که معمولاً سرم رقیق‌شده به آنتی‌ژن‌های کوت شده در فاز جامد اضافه می‌شود. آنتی‌ژن کوت شده آنتی‌ژن اختصاصی مربوط به آنتی‌بادی است که قرار است در نمونه ردیابی شود، پس از افزودن نمونه و طی زمان انکوباسیون و یک مرحله شستشو، آنتی‌هیومن گلوبولین نشان‌دارشده با آنزیم به چاهک اضافه می‌شود، برحسب اینکه چه کلاسی از آنتی‌بادی برای ردیابی اهمیت دارد نوع آنتی‌هیومن مورد استفاده نیز متفاوت است؛ مثلاً برای ردیابی آنتی‌بادی کلاس IgG از آنتی‌هیومن IgG و برای ردیابی کلاس IgA از آنتی‌هیومن IgA استفاده می‌شود. بهترین مثال‌ها در مورد این روش تعیین آنتی‌بادی علیه توکسوپلاسما، روبلا، ویروس سیتومگال و هلیکوباکتر پیلوری از کلاس IgM،IgA و IgG در سرم می‌باشد {منابع ۴ و ۵}.

 

  • الایزای ساندویچ

روش ساندویچ الایزا خود به دو دسته تقسیم می‌شود:

  • روش Ag محاصره‌ای یا Ab sandwich:

در این روش یک آنتی‌ژن در بین دو آنتی‌بادی اختصاصی قرار می‌گیرد، این روش شایع‌ترین روش الایزا محسوب می‌شود. در این روش از یک آنتی‌بادی برای به دام انداختن آنتی‌ژن بر روی چاهک‌های الایزا استفاده‌ می‌شود و آنتی‌بادی دوم که با آنزیم نشان‌دار شده است به‌عنوان شناساگر عمل می‌کند. قابل ذکر است که در این روش آنتی‌ژن باید دارای دو ناحیه آنتی‌ژنیک متفاوت باشد تا قادر به اتصال به هر دو آنتی‌بادی باشد. مثال‌های بارز این روش اندازه‌گیری هورمون‌های TSH، LH،FSH ،PSA ،HCG  و… می‌باشد.

  • روش Antibody محاصره‌ای:

این روش از طریق به دام انداختن آنتی‌بادی اختصاصی به روش ساندویچ میزان آن را سنجش می‌کند. برای این کار دو روش موجود است:

۱: Ag sandwich or Direct Ab capture

این روش یکی از اختصاصی‌ترین و حساس‌ترین روش‌ها برای تشخیص آنتی‌بادی در نمونه است. روش کار به این صورت است که از یک آنتی‌ژن کو‌ت‌شده یا پوشانده‌شده بر روی فاز جامد برای به دام انداختن آنتی‌بادی اختصاصی استفاده می‌شود و همان آنتی‌بادی از طریق بازوی دیگر خود (Fab)، پذیرای همان آنتی‌ژن اما به‌صورت نشان‌دار می‌باشد. درنتیجه آنتی‌بادی اختصاصی در میان دو آنتی‌ژن ساندویچ می‌شود.

 

۲: Indirect Ag Sandwich or indirect Ab Capture

در این روش پس از به دام انداختن آنتی‌بادی توسط آنتی‌هیومن گلوبولین پوشانده‌شده در کف چاهک‌ها، آنتی‌ژن اختصاصی را اضافه کرده و پس از تشکیل کمپلکس، از یک آنتی‌بادی اختصاصی نشان‌دار به‌عنوان سیستم شناساگر علیه آنتی‌ژن استفاده می‌شود.

 

  • الایزای رقابتی یا مهاری

در روش‌های رقابتی، اساس سنجش بر رقابت دو آنتی‌ژن یا دو آنتی‌بادی (که یکی از آن دو نشان‌دار است) برای اتصال به آنتی‌ژن یا آنتی‌بادی پوشانده‌شده در کف چاهک با مقدار محدود استوار است. اگر هر دو ماده نشان‌دار و غیرنشان‌دار با هم به سیستم اضافه شوند، روش را رقابتی و اگر ابتدا ماده غیرنشا‌ن‌دار اضافه شده و پس از یک دوره انکوباسیون ماده نشان‌دار اضافه گردد، روش را مهاری می‌نامند. مثال بارز روش‌های رقابتی و مهاری سنجش T3 و T4 می‌باشد. انواع روش‌های رقابتی عبارتند از:

 

۱: روش رقابتی یا مهارتی برای آنتی‌ژن

اساس این روش بر رقابت بین آنتی‌ژن نشان‌دار و آنتی‌ژن موجود در نمونه برای اتصال به یک آنتی‌بادی اختصاصی پوشانده‌شده در کف چاهک استوار است. در این روش مقدار آنتی‌بادی پوشاند‌ه‌شده باید محدود باشد و ملکول سیگنال‌دهنده همان آنتی‌ژن نشان‌دار است. اساس RIA و EIA کلاسیک بر همین روش استوار است.

 

۲: روش رقابتی برای آنتی‌بادی

در این روش بین دو آنتی‌بادی، یکی در نمونه به‌صورت غیرنشان‌دار و دیگری به‌صورت نشان‌دارشده با آنزیم برای اتصال به یک آنتی‌ژن پوشانده‌‍‌‌‌شده در چاهک، رقابت صورت می‌گیرد. بدیهی است که هرچه مقدار آنتی‌بادی نمونه بیشتر باشد آنتی‌بادی نشان‌دار کمتری به چاهک‌ها متصل شده و سیگنال نیز کمتر خواهد بود. شاخص‌ترین مثال این روش اندازه‌گیری آنتی‌بادی بر ضد HBc است.

 

روش‌های کاهش خطا در الایزا

برای کاهش میزان خطا در نتایج آزمایشات الایزا موارد زیر می‌بایست رعایت شوند:

  1. اطلاعات بالینی بیمار به‌طور کامل در برگ پذیرش ثبت شود.
  2. نمونه‌گیری از بیمار باید به‌دقت انجام گیرد زیرا برخی عوامل به‌عنوان مثال بستن گارو یا تورنیکه به مدت طولانی ممکن است موجب ایجاد خطا در اندازه‌گیری شود.
  3. دقت در نحوه جداسازی سرم از لخته به‌نحوی‌که سرم جداشده حاوی فیبرینوژن یا ذرات دیگر نباشد.
  4. نمونه مورد استفاده لیز، زرد رنگ (یرقان) و چربی‌دار نباشد.
  5. تا حد امکان از فریز و دفریز کردن نمونه‌ها جلوگیری شود.

 

برخی نکات که قبل از انجام آزمایش می‌بایست مورد توجه قرار گیرند عبارتند از:

  1. حمل‌ونقل کیت‌ها و همچنین نگه‌داری آنها باید در دمای ۲ تا ۸ درجه صورت گیرد.
  2. قبل از خریداری کیت مورد مصرف بهتر است آن را از لحاظ اعتبار کمپانی سازنده، تاریخ تولید، بسته‌بندی مناسب و نیز موجود بودن تمامی استانداردها و کنترل‌های مثبت و منفی بررسی کنید.
  3. لوازم حجمی مانند سمپلرهای مورد استفاده کنترل‌شده باشند.
  4. اطمینان از کارکرد صحیح دستگاه‌ها و تجهیزات مورد استفاده، به‌عنوان مثال اطمینان از صحت طول‌موج فیلترهای الایزا ریدر با استفاده از ماده رنگی باثبات، مانند بی‌کربنات پتاسیم و یا عملکرد صحیح دستگاه شستشودهنده
  5. آماده‌سازی بافر یا محلول شستشو با دقت کامل و به‌اندازه موردنیاز برای هر بار مصرف و همچنین عدم استفاده از محلول‌های شستشوی نامناسب یا آب مقطر ناخالص
  6. استفاده از نوک سمپلرهای یک بار مصرف و لوله آزمایش عاری از هرگونه مواد شوینده و پاک‌کننده
  7. برای سوبسترا بهتر است از لوله شیشه‌ای که با اسید سولفوریک رقیق شسته شده و با آب مقطر دو بار تقطیر آب‌کشی شده استفاده کرد.

 

نکاتی که هنگام انجام تست‌های الایزا می‌بایست مورد توجه قرار گیرند عبارتند از:

  1. تمامی محلول‌های موجود در کیت می‌بایست قبل از مصرف، خوب مخلوط و به دمای آزمایشگاه برسند.
  2. محلول‌های موجود در کیت باید قبل از مصرف از لحاظ کدورت و آلودگی قارچی و ذرات خارجی بررسی شوند.
  3. درب پاکت حاوی میکروپلیت‌ها بعد از رسیدن به دمای اتاق باز شود و برای جلوگیری از ورود گردوغبار و رطوبت به داخل آنها سریعاً پس از جداسازی تعداد استریپ موردنیاز به داخل کیسه منتقل شوند.
  4. در هر نوبت کاری از کلیه استانداردها و کنترل‌های موجود در کیت استفاده شود.
  5. برای افزایش پایداری بهتر است کیت بازشده پس از استفاده بلافاصله به یخچال منتقل شود.
  6. عمل بهم زدن و مخلوط نمودن محتویات چاهک‌ها باید به‌آرامی صورت گیرد تا از ایجاد حباب یا انتقال محلول از یک چاهک به چاهک‌های مجاور جلوگیری شود.
  7. جهت اطمینان از سالم بودن سوبسترا و کونژوگه، حجم‌های مساوی از این دو را با هم مخلوط نمایید. در این صورت رنگ موردنظر می‌بایستی به‌سرعت ایجاد شود.
  8. برای پیپت نمودن محلول‌ها و جلوگیری از پرتاب قطعات به سایر چاهک‌ها و همچنین یکسان بودن شرایط برای تمامی چاهک‌ها از یک تکنیک ثابت استفاده کنید، بهتر است برای این منظور عمل پیپت کردن به‌طور مایل و چسبیده به جدار فوقانی چاهک‌ها صورت پذیرد.
  9. کنترل اتصال محکم نوک سمپلر به بدنه آن در حین کار ضروری است.
  10. بهتر است از مخلوط نمودن محلول سوبسترای تازه آماده به کار با محلول قبلی اکیداً خودداری شود.
  11. سطوح زیرین چاهک‌ها باید عاری از خراش و کثیفی یا برجا ماندن اثر انگشت باشد.
  12. جلوگیری از بروز نوسانات ناگهانی دما در هنگام انکوباسیون توسط عوامل محیطی ضروری می‌باشد؛ زیرا شوک حرارتی و اختلاف حرارت محیط کار و محیط داخلی انکوباتور به‌واسطه ورود ناگهانی سرمای محیط به داخل انکوباتور موجب جذب نوری غیریکنواخت خصوصاً در استریپ‌های ابتدایی می‌شود.
  13. در مراحل مختلف شستشو دقت شود ذرات کونژوگه آنزیمی در کف چاهک‌ها باقی نماند.

 

دستگاه خوانش الایزا Reader ELISA

دستگاه‌های معروف به خوانش الایزا اسپکتروفتومتری ساده می‌باشند که برای خواندن همزمان ۹۶ چاهک (پلیت ۹۶ خانه‌ای) تخصص یافته‌اند (شکل ۳).

اصول الایزا

شکل ۳. یک نمونه دستگاه الایزا ریدر

 

اصول کارکرد دستگاه خوانش

این دستگاه در اصل یک فتومتر ساده است که نوع کووت و مسیر خوانش آن کمی تغییر کرده است؛ بدین صورت که مسیر تابش نور به نمونه برخلاف اسپکتروفتومتر به‌صورت عمودی است. اجزای اصلی دستگاه خوانش شامل منبع نور، فیلتر، چاهک، آشکارساز و نمایشگر است. وظیفه آن طیف‌سنجی نوری یا خوانش دانسیته نوری واکنش الایزا است. نور به‌وسیله یک باطری یا منبع تغذیه‌کننده دیگر با ولتاژ ثابت ایجاد می‌شود. طول‌موج مشخصی از نور از پایین درون چاهک می‌گذرد که در مسیر آن فیلتر مناسبی با توجه به نوع آنزیم و نوع سوبسترای آنزیم جهت دستیابی به طول‌موج مطلوب قرار داده می‌شود. در بسیاری از خوانشگرها، سیستم تک موج یا دو موج است و جهت برطرف‌سازی نقص سیستم نوری تغییرات چاهک به چاهک حجم نهایی در چاهک‌ها، تصحیح جذب نوری به‌طور خودکار صورت می‌گیرد. این عمل توسط فیلترهای تفاضلی انجام می‌شود. در دستگاه خوانشگر انتخاب طول‌موج توسط فیلترها یا گریدها انجام می‌شود. در اینجا انرژی نورانی به انرژی الکتریکی تبدیل می‌شود، سپس این انرژی به‌عنوان میزان جذب‌شوندگی، خوانده می‌شود و بر روی یک گراف یا به‌صورت دیجیتال نشان داده می‌شود.

 

انواع الایزا ریدر

دستگاه‌های خوانشگر الایزا بر اساس نوع و سیستم خوانشگر به سه دسته تقسیم می‌شوند:

۱: تک خوانشگر (Single Reader)

در هر بار خوانش تنها یک چاهک را به طریق دستی قرائت نموده و هیچ‌گونه امکانات محاسباتی ندارد، لذا بایستی منحنی استاندارد تست‌ها توسط فرد آزمایش‌کننده به‌صورت دستی رسم شود، به همین علت از قیمت و کیفیت پایینی برخوردار است.

 

۲: خوانشگر نواری (Strip reader)

تعداد ۱ الی ۳ ردیف چاهک نواریِ ۸ یا ۱۲ خانه‌ای را به‌صورت خودکار قرائت نموده و درعین‌حال منحنی تست‌ها را بر اساس مُد محاسباتی رسم می‌نمایند. علاوه براین، به علت دارا بودن Differential Filters قابلیت خوانش در دو طول‌موج را به‌طور همزمان دارند.

 

۳: خوانشگر صفحه‌ای (Plate reader)

قابلیت خواندن یک صفحه چاهک ۹۶ خانه‌ای نمونه را در حداقل زمان دارا بوده و از سرعت، دقت و صحت بیشتری نسبت به دستگاه‌های خوانشگر نواری برخوردارند، ازاین‌رو قیمت بالاتری نیز دارند.

 

  • منابع نور

بسیاری از منابع نور در محدوده فرابنفش- مرئی استفاده می‌شوند. لامپ‌هایی که فیلامان آنها تنگستن است و طول‌موج آنها در محدوده ۳۰۰ تا ۹۰۰ نانومتر می‌باشد، برای محدوده نور مرئی استفاده می‌شود. از این لامپ‌ها برای اندازه‌گیری محلول‌هایی که میزان غلظت آنها در حد متوسط بوده و شدت رنگ با میزان غلظت به‌شدت تغییر می‌یابد، استفاده می‌شود. از لامپ‌های هیدروژنی یا دوتریومی که محدوده طول‌موج آنها ۲۰۰ تا ۴۵۰ نانومتر می‌باشد، در محدوده طیف ماورای بنفش استفاده می‌شود. لامپ‌های دوتریومی نسبت به لامپ‌های هیدروژنی پایدارتر و بادوام‌تر هستند.

در دستگاه خوانشگر از یک یا دو شعاع نور استفاده می‌شود. در دستگاه‌های دقیق جدید با شعاع منفرد نور، میزان جذب‌کنندگی محلول به‌طور جداگانه مشخص می‌شود و سپس به‌وسیله میکروکامپیوتری که به سیستم متصل شده و یا به‌طور مستقل عمل می‌کند، پردازش می‌شود؛ اما در دستگاه‌هایی که شعاع نوری آنها دوتایی است، شعاع نور به‌طور خودکار از هم جدا شده و از میان نمونه مورد آزمایش و نمونه استاندارد عبور کرده و تفاوت میان آنها را به‌طور مستقیم محاسبه نموده و نشان می‌دهد. در برخی از دستگاه‌ها، شعاع نوری پس از برخورد به آینه‌ای به دو بخش تقسیم می‌شود، نیمی از شعاع نوری از میان نمونه مورد آزمایش و نیمی دیگر از میان نمونه استاندارد عبور خواهد کرد. در برخی از دستگاه‌ها از تقسیم‌کننده نور استفاده می‌کنند که یک آینه ‌گردان است که با سرعت بالایی می‌چرخد. نوری که به این آینه‌ گردان می‌تابد، به‌طور متناوب نور را به‌طرف نمونه مورد آزمایش و بازتاب نور را به‌طرف نمونه استاندارد می‌فرستد.

 

  • فیلترها

در این دستگاه‌ها از فیلتر یا صافی برای کنترل قابلیت ارسال، بازتاب و جذب‌شوندگی انرژی الکترومغناطیسی که انتقال می‌یابد، استفاده می‌شود. با توجه به اینکه در طراحی سیستم‌های الایزا از آنزیم‌ها و سوبستراهای مشخصی استفاده می‌شود، در کاربردهای رایج آزمایشگاهی به طول‌موج‌های مشخص و یا فیلترهای محدودی نیاز است. رایج‌ترین فیلترهای موردنیاز برای کیت‌های رایج الایزا عبارتند از: ۶۳۰، ۵۴۰، ۴۹۲، ۴۵۰، ۴۰۵ نانومتر؛ تقریباً اغلب دستگاه‌های موجود دارای ۵ فیلتر فوق می‌باشند و یا حداقل جایگاه نصب آنها تعبیه شده است. ممکن است به دلیل کاربرد کمتر طول‌موج ۵۴۰ نانومتر، این فیلتر حذف شده باشد، اما در دستگاه‌هایی که مانند اسپکتروفتومترها از توری‌های پراش استفاده می‌کنند، محدوده وسیعی از طول‌موج بین ۴۰۰ تا ۷۵۰ نانومتر پوشش داده می‌شود.

 

  • چاهک‌ها

چاهک‌ها روی تمام سطح میکروپلیت به‌صورت ته‌‍‍‍‌صاف و یا ته‌گرد هستند و از شیشه چند بار مصرف و یا پلاستیک یک بار مصرف ساخته شده‌اند.

 

  • آشکارسازها

سلول‌های حساس به نور از ساده‌ترین آشکارسازها هستند که با توجه به‌شدت نوری که به آنها برخورد می‌کند، جریان لازم را تولید می‌کنند. از ترانزیستورهای نوری و دیودهای نوری نیز می‌توان به‌عنوان آشکارساز استفاده کرد. برای نورهایی که شدتشان کم است از لوله‌های افزاینده نوری، استفاده می‌شود. کلیه حفره‌هایی که نمونه را در خود جای می‌دهند به دلیل بازتاب سطح صفحه، یکنواخت نبودن دیواره‌ها و پخش شدن نور در مایع، باعث کاهش شدت نور می‌شوند.

برای اندازه‌گیری در محدوده نور مرئی، استفاده از    Phototube که برای اندازه‌گیری طیف مرئی استفاده می‌شود، کافی است؛ اما فتوتیوب‌ها، نور کمتر از ۳۵۰ نانومتر را جذب می‌کنند. برای نورهایی که طول‌موج آنها در این محدوده هستند، باید از کوارتز یا سیلیکای فشرده استفاده کرد.

 

  • ثبت‌کننده

این دستگاه‌ها اطلاعات گرفته‌شده از آشکارساز را به‌صورت آنالوگ و یا دیجیتال نشان می‌دهند.

یکی از پارامترهای مهم در دستگاه خوانش، مدت زمان خوانش است. هرچقدر این مدت زمان کوتاه‌تر باشد، یکنواختی خوانش بیشتر است. دستگاه‌های قدیمی حدود سه دقیقه زمان برای قرائت کل لازم داشتند که اغلب بین نتایج اولین چاهک و آخرین چاهک درصورتی‌که به یک نمونه مشترک مربوط بودند، اختلاف وجود داشت ولی امروزه دستگاه‌های جدید، خوانش سه طول‌موج را در زمانی کمتر از ۳ ثانیه انجام می‌دهند.

 

سیستم تکان‌دهنده Shaking System

تکان دادن میکروپلیت‌ها از مهم‌ترین بخش‌های تکنیک الایزا است، چراکه تأثیر زیادی در تغییر رنگ محیط آنزیمی پس از افزودن محلول اسیدی دارد. استفاده از سیستم تکان‌دهنده معمولی با قطر چرخش زیاد و تعداد دور کم و در نتیجه تکان دادن آهسته میکروپلیت‌ها باعث خوب مخلوط نشدن معرف‌ها در نتیجه ادامه و پیشرفت جزئی واکنش در طی زمان و بروز خطا می‌شود. این دستگاه برای مخلوط کردن محتویات میکروپلیت‌ها به‌‌کار گرفته می‌شود. این دستگاه با حرکت سریع با قطر چرخش کم باعث اختلاط مناسب معرف‌ها و در نتیجه پیشرفت واکنش در طی زمان می‌شود (شکل ۴).

اصول الایزا

شکل ۴. نمونه‌ای از دستگاه تکان‌دهنده

 

الایزا واشر

میکروپلیت واشر یا الایزا واشر که به شستشودهنده پلیت نیز معروف است برای انجام عملیات شستشو که در تکنیک الایزا لازم است، طراحی شده است (شکل ۵). در روش الایزا، شستشو به دو صورتِ دستی و دستگاهی انجام می‌شود. روش دستی معمولاً با استفاده از میکروپیپت‌های تک یا ۸ کاناله و همچنین برخی توزیع‌کننده‌های دستی انجام می‌گیرد. کار الایزا واشر شستن چاهک‌های پلیت‌های الایزا طی مراحل مختلف تکنیک الایزا به‌صورت اتوماتیک یا نیمه اتوماتیک می‌‌باشد.

اصول الایزا

شکل ۵. الایزا واشر

 

اصول کار دستگاه

همانطور که ذکر شد الایزا واشر دستگاهی است که عمل شستشو در تکنیک الایزا را انجام می‌دهد. هدف تولیدکنندگان این دستگاه، طراحی وسیله‌ای بوده که ضمن عدم ایجاد اختلال در تکنیک الایزا، زیرمجموعه‌ای از دستگاه‌های موردنیاز این ‌روش باشد که نیاز کاربر را به وسایل اضافی برطرف نماید.

به‌طور کلی دستگاه الایزا واشر به‌وسیله میکروپروسسورهایی کنترل می‌شود که مراحل برنامه‌ریزی و کنترل عمل شستشو را اجرا می‌نماید، به‌عنوان مثال کنترل دفعات چرخه شستشو، زمان‌های موردنیاز جهت شستشو، بکار بردن و تنظیم فشارها، تنظیم عملکرد مکش و …

تمام موارد یادشده جزئی از سیستم کنترلی دستگاه را تشکیل می‌دهند. سیستم کاربردی دستگاه از یک مخزن محلول شستشو، یک مخزن پسماند (برای پسماند تولیدشده طی فرآیند شستشو)، یک یا چندین پمپ و سرنگ‌هایی تشکیل شده که محلول شستشو را وارد چاهک‌ها می‌کنند.

 

ساختمان دستگاه

۱: سیستم کنترل

بطورکلی الایزا واشر توسط سیستم میکروپروسسوری کنترل می‌شود. این سیستم وظیفه برنامه‌ریزی و کنترل مراحلی مانند تعداد چرخه‌های شستشو، زمان مورد انتظار، ریختن و کشیدن مایعات و … را برعهده دارد.

 

۲: سیستم توزیع‌کننده

این مجموعه به‌طور معمول شامل یک مخزن برای ذخیره محلول شستشو، یک سر توزیع‌کننده و یا یک یا چند پمپ می‌باشد. قسمت سر توزیع‌کننده معمولاً دارای ۸ جفت سوزن برای شستشو و مکش همزمان چاهک‌های یک ردیف می‌باشد و به‌نوعی مجموعه سیستم‌های پخش و کشش در قسمت سر با هم تلاقی دارند. در بعضی از مدل‌ها تعداد سوزن‌ها ۱۲ جفت است و برخی از مدل‌های پیشرفته فرآیند شستشو را به‌طور همزمان برای همه چاهک‌ها انجام می‌دهند. برخی از الایزا واشرها قابلیت کار با انواع مختلف محلول‌های شستشو را دارند و تغییرات محلول را مطابق برنامه‌ای که اپراتور به آن می‌دهد انجام می‌دهند.

 

۳: سیستم مکش

این سیستم نیاز به یک مکانیزم ایجاد خلأ و همچنین یک مخزن جهت جمع‌آوری مایعات و پسماند برداشته‌شده از چاهک‌ها دارد. خلأ ممکن است توسط پمپ‌های داخلی یا خارجی تأمین شود. مکش توسط یک مجموعه از سوزن‌ها که بر روی شستشودهنده یا خشک‌کننده تعبیه شده است، انجام می‌شود. تعداد سوزن‌ها برحسب نوع شستشودهنده می‌تواند بین یک تا سه عدد تغییر کند؛ به این معنی که اگر فقط یک سوزن استفاده شود، عمل شستشو و مکش فقط با این سوزن انجام می‌شود؛ اما اگر دو سوزن بکار گرفته شود یکی برای توزیع محلول شستشو و دیگری برای تخلیه پسماند استفاده می‌شود و چنانچه سه سوزن داشته باشد، اولی برای تأمین محلول شستشو، دومی برای تخلیه و سومی برای کنترل محلول اضافه‌ای که در چاهک‌ها ممکن است موجود باشد، بکار می‌رود.

 

۴: سیستم پیشرفته رباتیک

مکانیزم این سیستم به این صورت است که بازوی مکانیکی که سر سیستم توزیع و تخلیه بر روی آن نصب شده است به‌طور افقی، محلول توزیع‌کننده را حرکت داده تا به بالای هر چاهک در پلیت الایزا برسد. وقتی به مکان موردنظر رسید، بازوی مکانیکی یک حرکت عمودی بسمت چاهک انجام می‌دهد و محلول شستشو توزیع و پسماند تخلیه می‌گردد.

 

نکات مهم هنگام شستشوی تست‌های الایزا

  1. هدف اصلی از شستشو، دفع و تخلیه کامل اتصال‌ها و ملکول‌های غیراختصاصی از محیط واکنش می‌باشد لذا رعایت دقیق تعداد دفعات و نحوه شستشو مهم است.
  2. فشار بالای شستشو در روش دستی به دلیل تخلیه سریع بافر، منجر به جداسازی و حذف اتصالات اختصاصی از کف چاهک‌ها و کاهش کاذب جذب نوری می‌گردد.
  3. فشار پایین شستشو به دلیل تخلیه آهسته بافر در روش‌های دستی منجر به عدم دفع کامل اتصالات غیراختصاصی و افزایش کاذب جذب نوری می‌گردد.
  4. در نظر گرفتن زمان خیس خوردن (soaking time) چاهک (۲۰ تا ۴۰ ثانیه)، در فواصل شستشو الزامی است؛ زیرا این مرحله به جداسازی و دفع کامل اتصالات غیراختصاصی کمک می‌کند.
  5. برای شستشو به روش دستی (با سمپلر) جهت جلوگیری از آسیب فیزیکی به چاهک الایزا و جداسازی کمپلکس‌های پوشیده‌شده در کف چاهک سعی کنید تخلیه نمونه به‌صورت مایل صورت گیرد.
  6. در پروسه شستشو بهتر است تا نزدیک لبه فوقانی چاهک از محلول شستشو پر شود. پر کردن لبالب چاهک‌ها از محلول شستشو احتمال آلودگی از یک چاهک به چاهک دیگر را افزایش می‌دهد.
  7. نکته مهم در شستشوی دستی و با سمپلر، جلوگیری از ایجاد حباب هوا در چاهک‌ها و جلوگیری از سرریز شدن محلول شستشو و نیز تماس با کف چاهک‌ می‌باشد چراکه منجر به کاهش کاذب جذب نوری می‌شود.
  8. بافر فسفات سالین از مناسب‌ترین محلول‌های ایزوتونیک شستشو دهنده می‌باشد که کمترین اثرات تخریبی را روی کمپلکس آنتی‌ژن– آنتی‌بادی دارد.
  9. در شستشو به روش دستی در مرحله مکش، چاهک‌ها می‌بایست به‌طور کامل تخلیه شوند و هیچ قطره اضافی از مایع بافر در کف چاهک‌ها باقی نماند. این کار با برگرداندن یک‌باره‌ی میکروپلیت روی کاغذ جاذب و بدون پرز قابل اجرا می‌باشد.
  10. توصیه می‌شود جهت شستشوی سریع و راحت‌تر، برای دستیابی به نتایج دقیق‌تر از الایزا واشر استفاده شود.
  11. خوانش میزان جذب محتوی چاهک‌ها توسط الایزا ریدر می‌بایست در زمان تعیین‌شده انجام شود.

 

نگهداری

  • برنامه نگهداری روزانه دستگاه الایزا
  • بازبینی سنسورهای نوری هر کانال از نظر تمیز بودن. چنانچه کثیف هستند سطح پنجره‌های عبوردهنده نور و سنسورها را با یک برس کوچک تمیز کنید.
  • بررسی روزانه تمیز بودن سیستم نوری
  • بررسی کالیبراسیون میکروپلیت ریدر یا خوانشگر؛ به این منظور اجازه دهید دستگاه هنگام شروع کارهای روزانه به مدت ۳۰ دقیقه روشن بماند تا گرم شود، سپس بلانک را قرائت و بعد یک پلیت شامل سوبسترا را قرائت کنید. خوانش‌ها باید یکسان باشد، اگر این‌طور نبود، پلیت را چرخانده و قرائت را به‌منظور تعیین اینکه آیا اختلاف در پلیت یا در خوانشگر است، تکرار کنید.
  • برنامه نگهداری ۳ ماه یک‌بار الایزا
  • بررسی پایداری لامپ، به این منظور از پلیت کالیبراسیون استفاده می‌شود؛ به این صورت که دو قرائت با فاصله ۳۰ دقیقه با همان پلیت انجام می‌شود و هیچ تفاوتی میان قرائت‌ها نباید مشاهده شود.
  • تمیز کردن سیستم‌های نوری و دتکتور
  • از تراز بودن هر چاهک با نور ساطع‌شده و سیستم آشکارکننده اطمینان حاصل نمایید.

 

اصول نگهداری و رفع اشکالات الایزا واشر

  1. وجود محیط تمیز و عاری از گردوغبار برای نصب دستگاه ضروری است.
  2. استفاده از یک میز ثابت که ابعاد آن متناسب با تجهیزات دستگاه مانند خوانش‌گر، انکوباتور، توزیع‌کننده و کامپیوتر و سایر تجهیزات جانبی دیگر بوده و در محلی دور از دستگاه‌های ایجادکننده لرزش مانند سانتریفوژ و شیکر قرار گرفته باشد.
  3. همیشه دستگاه در یک سطح تراز و افقی قرار گیرد.
  4. استفاده از پریزهای دارای سیم اتصال به زمین و ولتاژ برق متناسب با ورودی دستگاه
  5. برخی دستگاه‌ها در ورودی تیوب شستشو یک فیلتر دارند. هرچند وقت یک بار آن را تمیز نمایید.
  6. در ابتدای کار هر تست، لازم است ابتدا مسیر را از مایع شستشو قبلی خالی کنید.
  7. در پایان هرروز کاری لازم است کل مسیر عبور محلول‌ها را با آب مقطر شستشو دهید، با این کار از ایجاد رسوب در مسیرها جلوگیری خواهد شد.
  8. در صورت مسدود شدن سوزن‌های مانیفولد فقط از سوز‌ن‌های ارسالی همان دستگاه برای باز کردن سوزن مانیفولد استفاده کنید. در صورتی که از سوزن نامناسب استفاده کنید و سوزن در مانیفولد بشکند، بیرون آوردن سوزن شکسته تقریباً غیرممکن خواهد بود و مانیفولد باید تعویض شود.
  9. در زمان نقل‌وانتقال دستگاه به‌منظور جابجایی یا سرویس، ابتدا دستگاه را در یک کیسه نایلونی قرار دهید، سپس آن را در جعبه‌ای مقاوم قرار داده و به‌اندازه کافی در اطراف و زیر و بالای آن مواد ضربه‌گیر قرار دهید.

 

  • برنامه نگهداری روزانه الایزا واشر
  1. کنترل حجم توزیع‌شده در چاهک‌ها
  2. بررسی یکسان پرشدن چاهک‌ها
  3. کنترل اثربخش بودن سیستم مکش
  4. بررسی تمیز بودن سوزن‌های مخصوص مکش و توزیع‌کننده محلول‌ها
  5. تمیز کردن دستگاه واشر با آب مقطر پس از استفاده، به‌منظور حذف بقایای نمک موجود در سوزن‌های مکش و توزیع و نگهداری سوزن‌ها در آب مقطر
  6. سطح خارجی بدنه دستگاه واشر را با استفاده از پارچه آغشته به یک دترجنت ملایم می‌توان تمیز نمود.

 

  • برنامه نگهداری هر سه ماه دستگاه الایزا واشر
  1. کانال‌ها و اتصالات را باز کرده و تمیز نمایید. اگر نشت یا نشانه‌هایی از خوردگی دیده شد، آن را برطرف یا جایگزین کنید.
  2. طبق دستورالعمل سازنده، روغن‌کاری اجزای مکانیکی را انجام داده و سالم بودن قطعات را بررسی کنید.
  3. طبق دستورالعمل سازنده، کالیبراسیون را انجام دهید و تنظیم بودن هر یک از اجزای سیستم‌های ‌سازنده را بررسی کنید.
  4. سالم بودن اتصالات الکتریکی و کابل ارتباطی داخلی را بررسی کنید.
  5. پس از اتمام کار با استفاده از آب مقطر باقیمانده‌های نمک در کانال‌های سیستم‌های مکش و توزیع‌کننده دستگاه واشر را تمیز کنید.
  6. سالم بودن فیوز و تمیز بودن نقاط اتصالی آن را بررسی کنید.

 

بیشترین ایرادات دستگاه الایزا واشر مربوط به نقص‌هایی می‌باشد که در سیستم توزیع و مکش به وجود می‌آید که در ادامه به آنها می‌پردازیم.

 

  • نقص در سیستم توزیع

اگر صدای موتور دستگاه به‌گوش می‌رسد اما دستگاه محلول شستشو را توزیع نمی‌کند (یا خیلی کم می‌ریزد)، در حالی که محلول در ظرف پر می‌باشد، علت می‌تواند موارد زیر باشد:

  1. ممکن است شیئی سنگین روی تیوب (شلنگ) توزیع قرار گرفته باشد، به‌عنوان مثال ممکن است خود بطری محلول شستشو روی قسمتی از شلنگ سنگینی کند و مانعی برای حرکت محلول شود.
  2. ممکن است درب ظرف محلول شستشو خوب بسته نشده باشد و هوا و فشار مثبت کافی ایجاد نشود.
  3. در ابتدای تیوب توزیع گاهی یک فیلتر قرار دارد که لازم است از نظر تمیز بودن کنترل و بررسی شود.
  4. وقتی‌که درب بطری را می‌بندید، در اثر پیچاندن درب، تیوب متصل به آن نیز پیچ می‌خورد که اگر زیاد در هم پیچیده شود، در یک نقطه تا خورده و عبور مایع مختل می‌شود.
  5. چنانچه در ردیف خاصی از چاهک‌ها محلول شستشو کمتر از سایر چاهک‌ها ریخته ‌شود، احتمال گرفتگی مسیر توزیع وجود دارد، لذا لازم است با استفاده از سوزن مخصوص، مسیر توزیع مربوط به آن چاهک تمیز شود.
  6. ممکن است شیر برقی کنترل تخلیه خراب شده باشد.
  7. از اشکالات دیگر سیستم توزیع می‌توان موضوع چک کردن مداوم محلول شستشو از سوزن‌های توزیع را نام برد. این مسئله علل مختلفی می‌تواند داشته باشد مانند خارج شدن شلنگ مربوط به سوزن از زیر شیر برقی و یا خرابی شیر برقی که در نتیجه آن مسیر حرکت مایع همواره باز می‌ماند. همچنین اگر صدای غیرعادی از پمپ شنیده شود احتمال خرابی پمپ توزیع دور از انتظار نخواهد بود.

 

  • نقص در سیستم مکش

هنگامی متوجه این ایراد می‌شویم که دستگاه چاهک‌ها را به‌خوبی تخلیه نمی‌کند. عوامل زیر می‌توانند در ایجاد این نقص فنی دخیل باشند:

  1. ممکن است وسیله‌ای روی شلنگ تخلیه قرار گرفته باشد که مانع حرکت مایع می‌شود.
  2. در هم پیچیده شدن شلنگ متصل به بطری پسماند هنگام بستن درب بطری که در اثر آن خود شلنگ در نقطه‌ای دچار تاخوردگی شده باشد و مانع عبور مایع شود.
  3. تاخوردگی شلنگ در محل اتصال به بطری هنگامی که بطری پسماند نسبت به دستگاه در سطح بالاتری قرار گرفته باشد که این امر می‌تواند موجب انسداد مسیر تخلیه شود.
  4. چنانچه از یک ردیف چاهک‌ها عمل مکش خوب انجام نشود و مایع شستشو زیاد باقی بماند، علت می‌تواند انسداد کامل یا تقریبی سوزن مکش همان ردیف باشد که باید با استفاده از سوزن مخصوص مسیر را باز کرد.

 

کنترل کیفی الایزا

  • کنترل عملکرد لامپ و فیلترها

جهت کنترل عملکرد لامپ و فیلترهای دستگاه باید هر دو هفته یک‌بار طبق دستورالعمل شرکت سازنده دستگاه، وضعیت این قسمت‌ها را چک کرد؛ مثلاً در برخی دستگاه‌ها با فشار دادن کلید (Self OK) دستگاه به‌طور اتوماتیک شدت نور خروجی، چرخش فیلترها، حرکت Y-X حمل‌کننده پلیت، صفحه نمایشگر و پرینتر را چک کرده و نتیجه را نمایش می‌دهد. پس از پایان یافتن چک، دستگاه پرینتر نتایج را ثبت می‌کند. پیغام System Check OK معرف آن است که دستگاه آماده استفاده می‌باشد. کنترل دستگاه به طریق مذکور هم بایستی به‌طور دوره‌ای هم به هنگام بازگشت دستگاه از سرویس انجام شود. چنانچه اخطاری مشاهده شد به دفترچه راهنمای دستگاه مراجعه و یا با شرکت پشتیبان تماس بگیرید.

 

  • کنترلِ خطی بودن (Linearity)

خطی بودن دستگاه بایستی به‌طور ماهیانه مورد ارزیابی قرار گیرد. هدف از این آزمون تعیین قابلیت دستگاه در تبعیت از قانون بیر (Beer’s Law) می‌باشد که طبق این قانون غلظت محلول نسبت مستقیم با مقدار نور جذب‌شده دارد. توجه شود که کنترلِ خطی بودن در دستگاه الایزا یک پارامتر مهم در کارایی دستگاه است چرا که کنترل صحت فتومتریک تا حدود زیادی با گذاشتن استانداردهای مختلف در هر run کاری قابل کنترل می‌باشد، اما اگر خطی بودن دستگاه دچار اشکال باشد تفاوت‌های فاحشی در جواب‌ها حاصل می‌شود. فقدان Linearity در غلظت‌های بالا معمولاً نشان‌دهنده وجود نورهای ناخواسته (Stray light) است که می‌تواند به علت خرابی فیلترها باشد. جهت چک کردن Linearity دستگاه، ابتدا باید یک محلول با حداکثر جذب نوری در طول‌موج ۴۵۰ نانومتر یا نزدیک به آن را انتخاب نموده (محلول اسید پیکریک پیشنهاد می‌شود) و در تمام چاهک‌های پلیت بریزید و پلیت را در طول‌موج ۴۵۰ نانومتر قرائت نمایید. نتیجه جذب نوری تمام چاهک‌ها در صورت سالم بودن فیلتر بایستی بیشتر از ۰/۳ باشد، سپس یک‌بار دیگر بدون پلیت جذب نوری را قرائت می‌کنیم. در چنین شرایطی باید جذب نوری برای تمام چاهک‌ها بین ۰/۰۱± باشد. در صورتی که نتایج بالا حاصل نشد با شرکت پشتیبان تماس بگیرید.

 

  • TEST 186

جهت چک فیلترها می‌توانیم از برنامه TEST 186 استفاده کنیم؛ چنانچه عدد بدست آمده بین ۲ تا ۱۰ باشد عملکرد فیلترها مناسب است در غیر این صورت دستگاه را برای سرویس به شرکت پشتیبان ارسال نمایید. برای انجام تست ابتدا دستگاه را روشن کرده و ۱۵ دقیقه می‌گذاریم تا گرم شود و سپس بعد از ظاهر شدن کلمه Selection mode، دکمه Test را زده و سپس عدد ۱۸۶ را وارد کرده و Enter می‌کنیم. بعد از چند ثانیه چهار عدد برای فیلترهای ۰، ۱، ۲، ۳ ظاهر می‌شود که اگر این اعداد بین ۲ تا ۱۰ باشد نشان‌دهنده سلامت فیلترها می‌باشد (در فیلترهای نو این عدد به ۱۰ نزدیک‌تر است و در فیلترهای کهنه به ۲ نزدیک‌تر است).

 

  • کنترل صحت فتومتری

آزمون صحت فتومتری برای بررسی این مسئله که آیا حداکثر جذب نوری به مقدار مشخص در طول‌موج خاصی صورت می‌گیرد یا نه، کاربرد دارد؛ به عبارت دیگر هدف تعیین تفاوت جذب واقعی با جذب مشاهده‌شده می‌باشد. صحت فتومتری به توانایی لامپ در ارائه حداکثر تابش فتوالکتریک، نوع و کیفیت منوکروماتور (تک‌رنگ کننده) بستگی دارد.

برای بررسی صحت فتومتریک از محلول رنگ‌زای قلیائی دی‌کرومات پتاسیم استفاده می‌کنیم. با یک سمپلر مستقیماً از معرف فوق به داخل ۵ چاهک ریخته و در Absorption mode با فیلتر اولیه ۴۰۵ نانومتر و فیلتر افتراقی ۶۳۰ نانومتر جذب آن را می‌خوانیم و سپس میانگین آن را محاسبه می‌نماییم. عدد به‌دست‌آمده باید در محدوده ۰٫۰۴ ± ۰٫۲۳۵ قرار گیرد.

 

  • کنترل تکرارپذیری

برای پی بردن به وجود هرگونه اختلال در کثیف بودن حسگرها، لنزهای دستگاه و کالیبراسیون نامناسب یک یا چند کانال دستگاه و یا ناپایداری لامپ دستگاه، باید تکرارپذیری دستگاه را کنترل کنیم که در این حالت حداقل ۸ بار خوانش OD یا جذب نوری غلظت‌های مختلف انجام شود و سپس CV آن را محاسبه کرده که این مقدار باید کمتر از ۳ درصد باشد. برای انجام این کنترل ابتدا یک رقت ۱/۲ از معرف تهیه‌شده، برای کنترل خطی بودن تهیه کرده و سپس از معرف اصلی و معرف رقیق‌شده به ۸ چاهک اضافه کرده و در Absorption mode با فیلتر اولیه ۴۰۵ نانومتر و فیلتر افتراقی ۶۳۰ نانومتر جذب آن را می‌خوانیم و سپس میانگین، انحراف معیار (SD) و ضریب تغییرات یا CV آن را محاسبه می‌نماییم.

 

  • کنترل کالیبره بودن موتور جابجاکننده پلیت

با استفاده از پلیت‌های کالیبره که دارای سوراخ‌هایی در مکان‌های مشخص هستند، کنترل کالیبره بودن موتور صورت می‌پذیرد. این مکان‌ها، وضعیت قرارگیری سیستم نوری پلیت ریدر را مشخص می‌نماید. وقتی پلیت کالیبره با بلانک هوا خوانده شود، سوراخ‌های این مکان‌ها، در وضعیت مطلوب، جذبی در محدوده ۰٫۰۱۵۰ ± خواهند داشت.

 

کالیبراسیون و کنترل کیفی الایزا واشر

عملکرد صحیح الایزا واشر بی‌شک یکی از عوامل مهم برای انجام درست تکنیک الایزا است. بر این اساس کالیبراسیون الایزا واشر بسیار مهم است. برای این منظور بهتر است موارد زیر بررسی شوند:

 

  • موقعیت سوزن‌ها (سر تغذیه‌کننده و مکش)

ابتدا لازم است این سوزن‌ها تمیز و از نظر نداشتن انسداد بررسی شوند. سپس موقعیت عمودی و افقی آنها نسبت به چاهک‌ها به‌دقت تنظیم و چک شود. دقت شود که تماس سوزن با انتهای چاهک‌ها سبب ایجاد تداخلات مکانیکی بین نوک سوزن و سطح چاهک در طی عمل مکش می‌شود.

 

  • زمان مکش

تنظیم زمان مکش بسیار اهمیت دارد؛ زیرا عدم رعایت زمان دقیق مکش سبب بازگشت مجدد محلول متصل‌شده به دیواره چاهک‌ها به ته چاهک شده و پاسخ آزمایش را دچار خطا می‌نماید. همچنین طولانی شدن بیش از حد زمان مکش، موجب خشک شدن مواد پوشانده‌شده انتهای چاهک‌ها شده و خرابی آزمایش را به دنبال خواهد داشت.

 

  • حجم توزیع‌شده

حجم توزیع‌شده به کلیه چاهک‌ها می‌بایست یکسان و به‌اندازه ماکزیمم ظرفیت چاهک باشد، لذا بررسی تمیزی و عدم انسداد سوزن‌های توزیع‌کننده بسیار بااهمیت می‌باشد.

 

  • خلأ

میزان خلأ موردنیاز برای سیستم مکش باید بین ۶۰ تا ۷۰ درصد کالیبره شود، در غیر این صورت اگر خلأ به‌عنوان مثال خیلی قوی باشد سبب خشک شدن چاهک‌ها شده و فعالیت آنزیم در چاهک‌ها به مقدار قابل‌ملاحظه‌ای کم می‌شود و به دنبال آن نتایج تست‌ها کاملاً تغییر خواهند یافت.

 

  • دقت شستشودهنده

با استفاده از کیت کنترل کیفی می‌توان دقت الایزا واشر را بررسی نمود. توصیه می‌شود این آزمایش به‌صورت هفتگی انجام شود. روش آزمایش به این صورت است که ابتدا به چاهک‌های استریپ میزان ثابتی کنژوگه اضافه می‌نماییم. سپس ۴ مرتبه استریپ‌ها را با بافر شستشوی موجود در کیت شسته، سوبسترا و محلول توقف آزمایش را اضافه می‌کنیم. جذب چاهک‌ها را در طول‌موج ۴۵۰ نانو قرائت می‌کنیم. مقدار خوانش هر چاهک می‌بایست کمتر از ۰/۱ باشد در صورت بالاتر بودن، نشانه عدم کارایی شستشو بوده است.

جدول مشکل‌یابی مربوط به الایزا ریدر در ادامه آورده شده است.

 

جدول مشکل‌یابی الایزا ریدر

جدول مشکل‌یابی
مشکل علت محتمل راه‌حل
مقادیر قرائت شده دستگاه، ردیف به ردیف متفاوت است حسگرهای نوری کثیف هستند حسگرها را تمیز نمایید
لنز یا قسمتی از سیستم نوری کثیف است لنزهای سیستم نوری را تمیز کنید
یک یا چند کانال کالیبر نیست از کالیبربودن کانال‌ها اطمینان حاصل نمایید
 

پلیت‌خوان مقادیری را نشان می‌دهد که بی‌معنی است

 

لامپ کار نمی‌کند

لازم است لامپ با یک لامپ دیگر با همان مشخصات اصلی تعویض شود
 

 

 

 

 

پلیت‌خوان مقادیر جذب بالایی را نشان می‌دهد

تاریخ مصرف معرف به پایان رسیده یا به‌درستی انتخاب نشده است بررسی کنید که TMP بی‌رنگ و آماده‌سازی صحیح انجام گرفته است.
 

آلودگی (ناخالصی) در نمونه‌های دیگر است

بررسی نشانه‌گذاری، شستشوی آزمایش را تکرار کرده و ببینید که چگونه پیپت استفاده شده است
طول‌موج فیلتر درست نیست طول‌موج توصیه‌شده برای آزمایش را بررسی کنید و در صورت لزوم اصلاح کنید
شستشوی ناکافی یا غیرمؤثر انجام گرفته است روش شستشو را بررسی کنید، از یک روش کنترل کیفیت مناسب استفاده کنید
زمان انکوباسیون یا دما خیلی زیاد است زمان‌ها و دماهای انکوباسیون را بررسی کنید
از برخی معرف‌ها صرف‌نظر شده است بررسی کنید که آزمایش بر اساس روش‌های تعیین شده انجام گرفته است
رقیق‌سازی نادرست انجام شده است فرایند رقیق‌سازی را بررسی کنید
 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

پلیت خوان مقادیر جذب پایینی را نشان می‌دهد

 

زمان کوتاه انکوباسیون و دمای خیلی کم را بررسی کنید زمان‌های انکوباسیون و دماها را بررسی کنید
دمای معرف‌ها در محدوده دمای اتاق نیست پایداری معرف‌ها در دمای اتاق را بررسی کنید
پلیت بیش از حد شستشو داده شده است روند شستشو را بر اساس آنچه سازنده دستگاه توصیه کرده بررسی کنید
طول‌موج فیلتر نادرست است طول‌موج‌های انتخابی برای آزمایش را بررسی کنید و در صورت نیاز اصلاح کنید
تاریخ مصرف معرف به پایان رسیده یا به‌درستی انتخاب نشده است معرف‌های استفاده شده را بررسی کنید و رقیق‌سازها را آزمایش کنید
از برخی معرف‌ها صرف‌نظر شده است بررسی کنید که آیا آزمایش بر اساس روش تعیین شده انجام شده است
در پایین حفره‌های پلیت خراش‌هایی دیده می‌شود یک پلیت جدید تهیه کرده و آزمایش را تکرار کنید
 

پلیت انتخابی کثیف یا نادرست است

نوع پلیت استفاده شده را بررسی کرده و در صورت نیاز پلیت را تعویض و آزمایش را مجدداً تکرار کنید
پلیت درست قرار داده نشده یا به‌صورت ناقص در پلیت‌خوان قرار گرفته محل قرارگیری پلیت را بررسی کرده و قرائت را تکرار کنید
رطوبت یا اثر انگشت در قسمت بیرونی پایین پلیت وجود دارد بررسی کنید که پلیت زیر حفره‌ها تمیز است
خوانشگر پراکندگی غیرقابل انتظار در میزان جذب دارد لامپ دستگاه ثابت نیست لامپ را با لامپی دیگر با مشخصات لامپ اول جایگزین نمایید
 

اعداد جذب در مقایسه با محدوده ارزیابی نوری کاربر بسیار پایین است

 

اعداد با طول‌موج غیر از طول‌موج لازم برای آزمایش به‌دست‌آمده است

از درست بودن طول‌موج در زمان قرائت اطمینان حاصل نمایید. اگر طول‌موج صحیح نیست با طول‌موج درست، قرائت را تکرار نمایید. از انتخاب فیلتر با طول‌موج درست نیز اطمینان حاصل نمایید.
نمونه درست شناسایی نمی‌شود پلیت صحیح بارگذاری نشده است مراحل شناسایی نمونه را کنترل کنید. قرائت را بعد از تنظیم مراحل شناسایی نمونه کنترل کنید.
نمونه ثبت‌شده صحیح شناسایی نشده است
 

کامپیوتر کدهای خطا را نشان نمی‌دهد

برنامه‌ای که فعال بودن آلارم و پیغام‌های هشداردهنده را کنترل می‌کند، معیوب است و یا از طرف سازنده فعال نشده است  

از متخصص فنی کمک بگیرید

پلیت‌خوان نمی‌تواند خطاها را شناسایی کند اجزای مختلفی در سیستم دچار مشکل هستند، مانند سیستم شناسایی سطح مایع  

از متخصص فنی کمک بگیرید

 

برخی از منابع

  1. کتاب راهنمای نگهداشت تجهیزات آزمایشگاهی، ویرایش دوم، سازمان بهداشت جهانی، مترجمان: خانم مهری علی‌اصغرپور، مهناز صارمی
  2. کتاب تجهیزات آزمایشگاهی، اصول فنی و نگهداری و روش‌های کنترل کیفی، سیدبهزاد سید علیخانی
  3. کتاب اصول فیزیکی دستگاه‌های آزمایشگاهی، دکتر داریوش شهبازی گهرویی
  4. کرمی م، مهبد ا، شاددل م. مقایسه و حساسیت دو تکنیک ELISA و IFA با روش PCR در تشخیص انگل توکسوپلاسما گوندی در بین کودکان کمتر از یک سال بستری شده در بیمارستان طالقانی. علمی‌ پژوهشی ‌ارتش ۱۳۸۶
  5. Sucilathangam J, Palaniappan N, Sreekumar C, Anna T. IgG -Indirect fluorescent antibody technique to detect seroprevalence of Toxoplasma gondii in immunocompetent and immunodeficient patients in southern districts of Tamil Nadu. Indian Journal of Medical Microbiology 2010;28(4): 354-357.
  6. Maintenance Manual for Laboratory Equipment, 2end Edition, World Health Organization (book).
  7. Quality control in Shiraz Medical Laboratories by Farideh Razi (book)
  8. Enzyme-Linked Immunosorbent Assay (ELISA) technique in quality control of biological products and designing a specific kit for this purpose By “A. EMADI” Razi Vaccine & Serum Research Institute.
  9. احسان شریعت بهادری، «طراحی و تهیه کیت الایزا اویدیتی و مقایسه آن با روش الایزا در تشخیص توکسوپلاسما گوندی بر روی نمونه‌های سرمی و مایع آمنیوتیک»، پایان‌نامه دوره کارشناسی ارشد در رشته انگل‌شناسی پزشکی، دانشکده علوم پزشکی دانشگاه تربیت مدرس
  10. بررسی تکنیک‌ها و رفع خطا در الایزا، آزمایشگاه مرجع دانشگاهی قم

و …

 

[۱] Toxoplasmosis Other Infections Rubella Cytomegalovirus Herpes simplex

نکات عملی در تستهای الایزا

میکروپلیت واشر الایزا : اصول کار، خطاها و عیب یابی

الایزا ، روش‌های کنترل کیفی و مدیریت خطا

Elisa خطایابی

شستشو و ضدعفونی هم‌زمان تجهیزات پزشکی در ۵ دقیقه

برای دانلود پی دی اف بر روی لینک زیر کلیک کنید

 

برچسبها
  • آنتی بادی
  • آنتی ژن
  • اصول الایزا
  • ایمونوشیمی
  • مهندس احسان درخشان‌نیا

دیدگاهتان را بنویسید

نشانی ایمیل شما منتشر نخواهد شد. بخش‌های موردنیاز علامت‌گذاری شده‌اند *