گستره محیطی و شمارش افتراقی

دكتر حبيب‌ا… گل افشان

گستره خون محیطی و شمارش افتراقی . نمونه مربوط به آزمایش CBC یا هموگرام در لوله‌های با سرپوش ارغوانی (Lavender) حاوی K2EDTA یا Na2EDTA و یا K3EDTA به آزمایشگاه ارسال می‌شود. تهیه اسلاید در 2 تا 3 ساعت پس از نمونه‌گیری کیفیت خوبی را ارائه می‌دهد و معمولاً اسلاید تهیه شده از نمونه مانده در حرارت اتاق برای بیش از 5 ساعت دارای تغییرات ناشی از مانده شدن خون مانند مرفولوژی اکینوسیت، اسفروسیت و لکوسیت‌های نکروبیوتیک و نوتروفیل‌های واکوئله است.

واکوئله شدن منوسیت‌ها در خون EDTA دار به سرعت رخ می‌دهد، از این رو ارزش تشخیصی شبیه به واکوئله شدن نوتروفیل‌ها ندارد.

توجه داشته باشید که در ضد انعقاد EDTA پدیده اقماری پلاکت‌ها (Platelet satellitosis) و تجمع پلاکتی ناشی از EDTA موجب کاهش کاذب شمارش پلاکتی شده و در ضمن هر توده پلاکتی در دستگاه‌های شمارشگر به عنوان گلبول سفید شمارش شده و لکوسیتوز کاذب می‌دهد.

پدیده اقماری پلاکت‌ها (Platelet satellitosis) و تجمع پلاکتی ناشی از EDTA

تهیه مجدد نمونه خون در این موارد در لوله‌های حاوی سیترات سدیم، شمارش بهتری از پلاکت می‌دهد. شمارش پلاکت و گلبول‌های سفید بیمار را بایستی در عدد 1/1 به علت رقیق شدن در سیترات ضرب کرد. گفتنی است که پارامترهای دیگر CBC بایستی از روی CBC اولیه با نمونه EDTA دار برای بیمار گزارش شود.

تهیه گستره محیطی: (Manual wedge technic)

تهیه گستره محیطی به روش دو اسلایدی (Manual wedge technic) که یک اسلاید به عنوان پخش کننده به کار می رود بسیار متداول است. اسلاید پخش کننده باید دارای لبه‌های بسیار صاف و عرض آن کمتر از اسلاید گستره باشد به نحوی که حاشیه گستره محیطی هم قابل مطالعه باشد.

برای تهیه گستره به این روش یک قطره 2-3 میلی‌متری از نمونه خون که به خوبی مخلوط شده باشد را در انتهای یک سانتی‌متری از اسلاید تمیز و بدون گرد و خاک قرار داده و سپس لام پخش کننده را در جلوی قطره خون قرار داده و به آرامی به عقب می‌کشیم تا با قطره خون تماس پیدا کند و اجازه می‌دهیم تا خون در فاصله بین دو اسلاید پخش شود، پس از آن با یک سرعت ثابت لام پخش کننده را به سمت انتهای دیگر لام حرکت می‌دهیم تا خون به خوبی پخش شود. زاویه پخش کننده باید 45-30 درجه باشد، البته برای افراد مبتلا به پلی‌سایتمی می‌توان زاویه 25 درجه را انتخاب کرد و در افراد کم‌خون زاویه را افزایش داد.

خصوصیات یک گستره محیطی خوب

1- گستره خونی بایستی دو سوم تا سه چهارم طول اسلاید را بپوشاند.

2- حاشیه‌ها قابل مطالعه باشند.

3- گستره نازک، یکنواخت، بدون نامنظمی، بدون حفره هوا و بدون خش (Streak) باشد.

4- وقتی اسلاید در مقابل نور گرفته می‌شود قسمت نازک اسلاید حالت رنگین کمان (Rainbow) داشته باشد.

5- از تمام 3-2 میلی‌متر خون استفاده شده باشد.

6- گستره به تدریج از قسمت ضخیم به قسمت نازک برسد.

نکات مهم در تهيه گستره محيطي

زمان ايده‌آل براي تهيه گستره محيطي و مطالعه مرفولوژي گلبول‌هاي سفيد و قرمز حداکثر تا سه ساعت پس از نمونه‌گيري است، در حالي که سنجش پارامترها و شمارش سلول‌هاي خوني بشرطي که نسبت صحيح ضد انعقاد به خون رعايت شده باشد تا 24 ساعت در يخچال 4 درجه داراي اعتبار است.

نمک K₂EDTA ضد انعقاد سفارش شده از سوي کميته استاندارد سازي در هماتولوژي به مقدار 1/5 ±0/25 ميلي‌گرم به ازاي هر سي‌سي خون است.

گستره شعله شمعي حاشيه‌هاي اسلايد را قابل مطالعه ميکروسکوپي مي‌کند و با توجه به اينکه سلول‌هاي بزرگ و غيرطبيعي غالباً در حاشيه‌هاي اسلايد قرار مي‌گيرند از اين‌رو سفارش به تهيه اين نوع گستره گرديده و براي تهيه گستره‌ای که حاشیه آن قابل مطالعه باشد، کافي است که لبه پخش کننده (spreader) را با قلم الماس قطع کنيد.

توجه داشته باشيد که گستره بسيار نازک موجب پخش بسيار نامنظم گلبول‌هاي سفيد مي‌گردد، بنابراین ضخامت گستره بايستي در حد متوسط باشد.

در هنگام تهيه گستره امکان دارد سلول‌هاي لوسمي يا غيرطبيعي از نمونه خون توسط پخش کننده که خوب تميز نشده باشد به اسلايد بيمار ديگر منتقل شود. از اين‌رو تعويض پخش کننده بعد از تهيه گستره نمونه غير‌طبيعي و يا تميز کردن آن با گاز مرطوب و خشک کردن کامل آن براي هر بار استفاده سفارش مي‌شود.

براي ارزيابي گستره محيطي در بيماراني که غلظت خون دارند و تهيه گستره مشکل است مي‌توان يک قطره خون را با يک قطره آلبومين %5 يا پلاسماي گروه AB مخلوط و سپس اسلايد را تهيه و رنگ‌آميزي کرد.

براي جلوگيري از اسماج شدن سلول‌ها نيز مي‌توان يکي دو قطره از آلبومين بانک خون به نمونه خون اضافه و سپس گستره را تهيه کرد. اضافه کردن آلبومین %5 يا پلاسماي گروه AB به رسوب CSF نيز براي رنگ‌آميزي بهتر سلول‌ها سفارش مي‌شود.

رنگ‌آمیزی گستره

برای رنگ‌آمیزی از رنگ‌های رومانوفسکی مانند رایت و گیمسا استفاده می‌شود. این رنگ‌ها از دو بخش قلیایی و اسیدی تشکیل شده است. جزء بازی رنگ تیازین است که مخلوطی از متیلن بلو (تترا متیل تیونین) و نسبت‌های مختلفی از مشتقات دمتیله شده اکسیداتیو آن است که به نام رنگ‌های آژور خوانده می‌شود. آژور B (تری متیل تیونین)، آژور A (دی متیل تیونین)، آژور C (منو متیل تیونین) می‌باشد.

برای مثال رنگ رایت دارای 50 تا 75 درصد متیلن بلو و 10 تا 25 درصد آژور B و بقیه آن شامل سایر مشتقات رنگ می‌باشد.

جزء اسیدی رنگ، ائوزین است که مشتقی از اسکلت زانتین (Xanthene) است.

رنگ‌های رایت، گیمسا، جنر، مک نیل، لیشمن و می‌گرانوالد در خانواده رنگ‌های رومانوفسکی قرار دارند و هر کدام دارای مزیت خاص خود می‌باشند. برای مثال رنگ رایت برای آشکارسازی ساختارهای سلول، یک رنگ ایده‌آل و رنگ گیمسا برای رنگ‌آمیزی انگل مالاریا ایده‌آل است.

گستره قبل از رنگ‌آمیزی بایستی خشک شود. از دمیدن بر روی اسلاید به علت ایجاد رطوبت و تولید آرتیفکت آب خودداری کنید.

پس از خشک شدن، گستره را در عرض یک ساعت پس از تهیه با استفاده از یک رنگ رومانوفسکی حاوی فیکساتیو (رنگ رایت) رنگ‌آمیزی می‌کنیم و یا اینکه گستره را در عرض یک ساعت بوسیله متانول بدون آب، فیکس کرده و برای رنگ‌آمیزی توسط رنگ‌های فاقد فیکساتیو (مانند رنگ گیمسا) آماده می‌کنیم.

در رنگ‌آمیزی با رنگ رایت، متانول موجود در رنگ رایت به عنوان فیکساتیو به کار می‌رود و رنگ‌آمیزی واقعی اسلاید از زمانی صورت می‌گیرد که بافر به رنگ اضافه می‌شود. بافری که به اسلاید اضافه می‌شود دارای6.4 PH = است. از آب مقطر مانده شده در ظروف شیشه‌ای (حداقل 24 ساعت مانده باشد با پ هاش 6/4 تا 6/8) نیز می‌توان به عنوان بافر استفاده کرد، در غیر این صورت برای تهیه بافر 6/63 گرم از پودر بدون آب KH2PO4 و 2/56 گرم Na2HPO4 بدون آب را در یک لیتر آب حل می‌کنیم و پ هاش را روی 6/4 تنظیم می‌کنیم و از آن به عنوان بافر رنگ‌آمیزی با رنگ رایت استفاده مي‌كنيم. رنگ‌آمیزی بسیار وابسته به پ هاش است.

در رنگ‌آمیزی ابتدا اسلاید به مدت 1-3 دقیقه با رنگ رایت پوشانده می‌شود و سپس هم حجم رنگ به آن بافر اضافه کرده و با دمیدن، رنگ و بافر را مخلوط کرده تا جلای فلزی در سطح گستره ظاهر گردد و سپس مخلوط رنگ و بافر را برای مدت 3 دقیقه دیگر نگاه داشته و پس از آن اسلاید را با آب شستشو داده و پس از خشک شدن مورد مطالعه قرار می‌دهیم.

خصوصیات یک اسلاید با رنگ‌آمیزی خوب

1- با چشم غیرمسلح رنگ صورتی متمایل به بنفش کم‌رنگ دارد.

2- گلبول‌های قرمز صورتی رنگ هستند و نه به رنگ قرمز یا لیمویی

3- هسته گلبول‌های سفید بنفش ( ارغوانی) و سیتوپلاسم نوتروفیل دارای گرانول‌های خرمایی (Tan) است.

4- گرانول‌های ائوزینوفیل قرمز نارنجی و گرانول‌های بازوفیل بنفش تیره است.

نکات مهم در رنگ‌آمیزی گستره محیطی

بهترین رنگ‌آمیزی مربوط به نمونه‌های جدید است. اسلایدهایی که بیشتر از یک هفته مانده‌اند، آبی رنگ می‌گیرند.

قرار گرفتن اسلاید در برابر تابش نور خورشید موجب پژمردگی رنگ می‌شود.

رنگ‌آمیزی گلبول‌های قرمز به صورت آبی تا سبز رنگ نشانه افزایش زمان رنگ‌آمیزی یا قلیایی بودن بافر است. در این حالت گرانول‌های نوتروفیل نیز برجسته و تیره شبیه به گرانول‌های توکسیک می‌شود و گرانول‌های ائوزینوفیل آبی یا خاکستری می‌گردند.

کوتاه بودن زمان رنگ‌آمیزی یا اسیدی بودن محیط رنگ‌آمیزی یا اسیدی بودن بافر رنگ‌آمیزی یا اسیدی شدن رنگ به علت تبدیل متانول به اسید فرمیک موجب کاهش کیفیت رنگ‌آمیزی می‌گردد. گلبول‌های قرمز در این حالت قرمز روشن یا نارنجی بوده و هسته گرانولوسیت‌ها آبی کم‌رنگ است، گرانول‌های ائوزینوفیل قرمز درخشان است.

چنانچه اسلاید قبل از خشک شدن با لامل پوشانده شود نیز ایجاد آرتیفکت صورتی در رنگ‌آمیزی می‌کند.

رنگ‌آمیزی فوری اسلاید موجب جدا شدن قسمت ضخیم گستره از اسلاید می‌شود.

براي نگه‌داري گستره محيطي رنگ نشده بايستي آن را با متانول فيکس نمود. در غير اين صورت پروتئين‌هاي خشک شده در اسلايد کهنه موجب ايجاد زمينه آبي رنگ در رنگ‌آميزي شده و ارزيابي گستره را دشوار مي‌کند.

براي پاک کردن رسوب رنگ از سطح گستره مي‌توان آنرا براي چند ثانيه در متانول قرار داد و سپس ارزيابي کرد، چنانچه رسوب مانع از ارزيابي گستره شود، گستره جديد تهيه کرده و يا با متانول رنگ آن را کاملاً پاک کرده و دوباره رنگ‌آميزي کنيد.

اسلايدهاي رنگ‌آميزي شده با رنگ رايت را مي‌توان رنگ‌زدايي کرد و براي يک رنگ ديگر مانند رنگ‌آميزي آهن در موارد ضروري استفاده کرد.

آرتیفکت‌های ناشی از آب و خشک کردن

1-گلبول‌های قرمز با کناره‌های خورده شده (شبیه خوردن موریانه)

2- حضور هاله مرکزی واضح به علامت قرار گرفتن واکوئل در وسط گلبول قرمز به علت آرتیفکت آب

3- ایجاد مرفولوژی اکینوسیت در ناحیه‌ای از گستره که دیرتر خشک شده باشد.

4- هوای مرطوب ممکن است به گلبول‌های قرمز مرفولوژی اکینوسیت دهد.

براي جلوگيري از رخ دادن آرتيفکت آب (water artifact) بايستي از رنگ‌آميزي در هواي مرطوب و نمناک آزمايشگاه خودداري کرد. گفتني است که آلوده شدن الکل فيکساتيو يا رنگ به آب موجب ظاهر شدن واکوئل در گلبول‌هاي قرمز شده و چنانچه واکوئل‌ها در هاله مرکزي قرار گيرند گزارش کاذب هيپوکروم داده مي‌شود. اين مرفولوژي کاذب ناشی از آرتيکفت آب را توروسيت (torocyte) گويند.

رنگ‌آمیزی در هوای مرطوب یا آلوده شدن رنگ با آّب موجب ظهور واکوئل در سطح گلبول قرمز می‌شود.

اطلاعات مهم از شيوه رنگ‌آميزي شدن اسلايد

مشاهده گستره محيطي با زمينه آبي رنگ که با چشم غيرمسلح قابل مشاهده است ممکن است ناشي از مواد زير باشد:

افزايش پروتئين‌هاي فاز حاد در بيماري‌هاي التهابي و افزايش پاراپروتئين‌ها (پروتئين‌هاي مونوکلونال)، به علت تمايل به رنگ‌هاي متيلن‌بلو و آژور که از اجزاي رنگ‌هاي رومانوفسکي هستند ایجاد زمینه آبی رنگ مي‌کند.

گستره آبی رنگ با رنگ‌های رومانوفسکی

بنابراين زمينه آبي گستره ممکن است در موارد زير ديده شود:

1- کم‌خوني بيماري‌هاي مزمن به علت افزايش پروتئين‌هاي فاز حاد

2- سيروز کبدي ناشي از افزايش گاماگلوبولين

3- بيماري‌هاي آتوايمون ناشي از افزايش پلي‌کلونال گاماگلوبولين

4- مايلوم مالتيپل ناشي از انبوه ايمونوگلوبولين‌ها

5- حضور کرايوگلوبولين، ناشي از بيماري‌هاي التهابي يا هپاتيت يا اختلالات پلاسما سل

تهيه نمونه خون در ضد انعقاد هپارين و نيز قليايي بودن بافر رنگ‌آميزي ايجاد زمينه آبي مي‌کند.

قليايي بودن بافر به گلبول‌هاي قرمز و گرانول‌هاي ائوزينوفيل نماي آبي رنگ داده و گرانول‌هاي نوتروفيل را شبيه گرانول‌هاي توکسيک مي‌کند.

درگستره قرمز رنگ، ارزيابي مرفولوژي و شناخت سلول‌ها بسيار دشوار مي‌شود. از مهم‌ترين علت قرمز شدن گستره افزایش نسبت ضد انعقاد به خون است. رنگ‌آميزي در مجاورت بخار اسيد و آلوده شدن وسايل رنگ‌آميزي به اسيد نیز موجب رنگ قرمز گستره مي‌شود.

استفاده از متانول مانده و اکسيد شده به علت تبديل به اسيد فرميک، يکي ديگر از علت‌هاي گستره قرمز رنگ است.

گستره قرمز رنگ

گستره محيطي بايستي يکنواخت و فاقد هر گونه اجسام ذره‌اي (particles) در سطح آن باشد.

وجود اجسام ذره‌اي در سطح گستره ممکن است ناشي از موارد زير باشد:

1- کريستال‌هاي نامحلول ضد انعقاد در خون

2- آگلوتيناسيون سرد با ايجاد دستجات گلبول‌هاي قرمز

3-رسوب کرايوگلوبولين

4- توده‌هاي بهم چسبيده گلبول‌هاي سفيد، براي مثال در لوسمي‌ها

5- رشته‌هاي فيبرين

6- توده‌هاي کروماتين آزاد هسته که با خاصيت چسبندگی، سلول‌ها را به یکديگر می‌چسبانند.

7- نشستن ذرات گرد و خاک روی اسلاید

8-سلول‌هاي بهم چسبيده تومور از بافت خوني يا بافت‌هاي ديگر

9- تجمع سلول‌هاي پوششي جدار عروق يا آلوده شدن خون به سلول‌هاي پوششي پوست در هنگام تهيه نمونه

01- تجمعات پلاکتي به علت ذرات ريز لخته يا پديده تجمع پلاکتي در حضور نمک‌هاي EDTA

گستره محیطی با اجسام ذره‌ای در سطح آن

ارزیابی گستره محیطی

در هنگام مطالعه گستره محيطي بايستي نخست اطلاعات برگه CBC را با اطلاعات برچسب شده روي گستره مطابقت داد و سن و جنس بيمار را در تفسير پارامترها مد نظر داشت. براي مثال براي نوزاد نبايستي گزارش مرفولوژي ماکروسيتيک کرد چون به طور طبيعي مقدار MCV نوزاد بين 104 تا 120 فمتوليتر است. همچنین مشاهده هاول‌ژولي و تعدادي تارگت و اکانتوسيت در خون محيطي نوزاد به علت کم‌کاري فيزيولوژيک طحال نرمال است.

گستره خون محیطی ابتدا باید به صورت ماکروسکوپی مورد ارزیابی قرار بگیرد تا از لحاظ نحوه پخش خون بر روی گستره، تکنیک صحیح رنگ‌آمیزی و از نظر وجود هرگونه ذرات غیرطبیعی که ممکن است نشانه تجمع پلاکت‌های بزرگ (Giant) یا رسوب کرایوگلوبولین و یا تجمع سلول‌های توموری باشد، بررسی شود.

گستره محيطي داراي بخش‌هاي مختلف سر (Head)، دم (tail)، بدنه (body) و ناحيه شياری یا پر مانند (featherian) و ناحيه مرفولوژي (zone of morphology) است.

گلبول‌هاي قرمز در قسمت پر مانند يا شياري گستره محيطي فاقد هاله مرکزي بوده و به اشتباه ممکن است گزارش مرفولوژي اسفروسيت داده شود. لنفوسيت‌ها در اين ناحيه بزرگتر از اندازه طبيعي بوده و امکان گزارش لنفوسيت‌هاي آتپيک هست.

شمارش افتراقی و گزارش مرفولوژی را باید در ناحیه مرفولوژی (Zone of morphology) انجام داد. در این ناحیه گلبول‌های قرمز در کنار هم مانند سنگفرش موزائیک قرار دارند. شمارش افتراقی را می‌توان با حرکت زیکزاکی یا با حرکت جدید باتل منت ( (New battlement در ناحیه مرفولوژی انجام داد. در این حرکت دو میدان در حاشیه و سپس چهار میدان به طرف پایین و بعد دو میدان موازی حاشیه و سپس چهار میدان به طرف بالا و تکرار این حرکت تا پایان شمارش افتراقی انجام می‌شود. ممکن است که این شیوه از حرکت نیاز به مطالعه دو طرف اسلاید و در نتیجه کل اسلاید داشته باشد.گلبول‌های قرمز در ناحیه شیاری گستره فاقد هاله مرکزی بوده و به اشتباه گزارش اسفروسیت داده می‌شود.

ناحيه مرفولوژي که پشت قسمت پَر مانند است ناحيه‌اي تک لايه از گلبول‌هاي قرمز کنار هم، شبيه سنگفرش موزائيک بدون همپوشي و بدون فواصل نامتناسب است. در اين ناحيه شمارش افتراقي و تخمين گلبول‌هاي سفيد و پلاکت و مرفولوژي گلبول‌هاي قرمز مورد آناليز قرار مي‌گيرد.

تراکم سلولی بیش از 4 برابر در کناره‌ها و یا قسمت‌های پر مانند ناحیه دم اسلاید در مقایسه با قسمت‌های تک لایه و سنگفرشی دال بر اسلاید غیر قابل قبول با پخش نامتناسب است (Snow plow effect) و اسلاید باید مجدداً تهیه شود.

برای مشاهده میکروسکوپی ابتدا باید با درشت نمایی کم 10× وضعیت کلی اسلاید و پخش سلولی در کناره‌ها و قسمت پر مانند را بررسی کنیم.

در این درشت نمایی اسلاید از لحاظ موارد زیر بررسی می‌شود:

1- وجود رشته‌های فیبرین

2- وجود آگلوتیناسیون گلبول‌های قرمز، رولکس، تجمع پلاکتی

3- توزیع گلبول‌های سفید

گفتنی است که پدیده رولکس بایستی در سرتاسر گستره مشاهده شود. در ناحیه دم اسلاید ستونی شدن گلبول‌های قرمز به صورت دوتایی یا سه‌تایی بوده که هر چه به طرف سر اسلاید حرکت کنیم ستون‌های بزرگتر مشاهده می‌شود.

پدیده رولکس

درشت نمایی 40 ×

شمارش افتراقی و بررسی مرفولوژی سلول‌ها و تخمین شمارش گلبول‌های سفید با این درشت نمایی صورت می‌گیرد.

برای تخمین شمارش گلبول سفید، میانگین شمارش گلبول‌های سفید در 10 فیلد با درشت نمایی 40 را در عدد 2000 ضرب می‌کنیم. در میدان‌های انتخابی جهت انجام این روش بایستی بیشتر گلبول‌های قرمز در کنار هم بوده و تعدادی از RBCها به صورت دوتایی و یا سه‌تایی به هم چسبیده باشند.

برای مثال اگر با ارزیابی 8 تا 10 میدان میکروسکوپی میانگین 4 تا 5 عدد گلبول سفید شمارش شود شمارش گلبول سفید حدوداً 10000 -8000 در میلی‌متر مکعب است.

درشت نمایی 100 ×

از این درشت نمایی جهت شناسایی مواردی از قبیل گرانول‌های توکسیک، هاول‌ژولی بادی، پاپن‌هایمر و سایر انکلوزیون‌های داخل سلولی مانند آور راد و بازوفیلیك استیپلینگ، استفاده می‌شود. همچنین برای بررسی نهایی سلول‌های غیرطبیعی باید از این درشت نمایی بهره برد.

نکته:

چنانچه اسلاید با درشت نمایی 10 و 40 تنظیم شود ولی با درشت نمایی 100 فوکوس نشود احتمال دارد که اسلاید را برعکس زیر میکروسکوپ گذاشته باشیم.

روغن ایمرسیون برای افزایش ضریب شکست نور در هنگام استفاده از درشت نمایی 100 و 50 مورد استفاده قرار می‌گیرد.

ضریب شکست نور نسبت سرعت عبور نور در هوا به سرعت عبور نور در ماده است. روغن دارای خواص شبیه شیشه است و باعث می‌شود که عدسی شیئی نور بیشتری را دریافت کند. حباب هوا در روغن مانند منشور عمل می‌کند. برای برداشتن حباب عدسی شیئی را در روغن جابجا کرده تا حباب محو شود.

شیوه استاندارد گزارش مرفولوژی

شیوه استاندارد گزارش مرفولوژی در جدول مشاهده می‌شود. برای مثال چنانچه یک شکل غیر‌طبیعی مانند گلبول قطره اشکی در هر میدان با درشت نمایی 100 بین 1 تا 6 عدد باشد با درجه +1 یا Few و چنانچه در هر میدان بین 7 تا 10 عدد باشد با درجه +2 یاa few و چنانچه بین 11 تا 20 عدد باشد با درجه +3 یاmoderate و بیشتر از 20 عدد با درجه +4 یاmany گزارش می‌شود. آوردن پسوند osis مانندspherocytosis بیانگر درجه +4 است.

شمارش افتراقی

برای شمارش افتراقی بایستی به روش سیستمیک اسلاید را مورد مطالعه قرار داد و ناحیه صحیح را انتخاب کرد. در قسمت پر مانند گلبول‌های قرمز فاقد هاله مرکزی (شبه اسفروسیت) و لنفوسیت‌های بزرگ شبیه لنفوسیت‌های آتیپیک دیده می‌شود.

سفارش می‌شود وقتی که شمارش گلبو‌ل‌های سفید بیشتر از 40000 در میلی‌متر مکعب است. برای افزایش دقت حداقل 200 سلول شمارش افتراقی گردد و سپس درصد هر سلول محاسبه شود.

حاشیه اسلاید را در هنگام شمارش افتراقی مد نظر قرار دهید زیرا سلول‌های بزرگ مانند لنفوسیت‌های بزرگ، سلول‌های بلاست و منوسیت‌ها در آنجا تراکم بیشتری دارند.

در مواردی که شمارش افتراقی 100 سلول در بیمار مبتلا به لکوپنی مشکل است هیچگاه نتیجه شمارش افتراقی 20 یا 50 عدد سلول را در عدد 5 یا 2 ضرب نکنید و از آنجایی که شمارش افتراقی بر روی بافی‌کوت به دلیل پخش نامنظم سلول‌ها مشکل است در این موارد بهتر است که 2 تا 3 اسلاید تهیه کرده و جمع شمارش افتراقی را به 100 سلول برسانید.

لنفوسیت‌های آتیپیک را هم می‌توان بصورت مجزا درصد گرفت و هم می‌توان به صورت درصدی از کل لنفوسیت‌ها گزارش کرد و یا اینکه به صورت نیمه کمی از Slight تا Marked معادل 1+ تا 3+ گزارش کرد.

گلبول‌های قرمز را بایستی از لحاظ اندازه، تغییرات اندازه، تغییرات رنگ و تغییرات شکل و انکلوزیون‌ها مورد بررسی قرار داد. برخی از آزمایشگاه‌ها برای گزارش چنین مواردی از واژه‌های Slight (خفیف)، Moderate (متوسط) و Marked (شدید) استفاده می‌کنند.

برای تخمین پلاکت با بزرگنمایی 100 در منطقه‌ای که گلبول‌های قرمز پخش یکنواخت دارند از شمارش پلاکت‌ها در 10 فیلد میانگین گرفته و در عدد 20000 ضرب می‌کنیم. بایستی دقت کرد که در میدان‌های انتخابی حداقل 250 گلبول قرمز در مواردی که شمارش گلبول قرمز 5 میلیون در میلی‌متر مکعب است، و حداقل 200 گلبول قرمز در مواردی‌ که شمارش گلبول قرمز 4 میلیون در میلی‌متر مکعب است و حداقل 150 گلبول قرمز در مواردی که شمارش گلبول قرمز 3 میلیون در میلی‌متر مکعب است، وجود داشته باشد.

پارامترهای مربوط به گلبول‌ها:

پارامترهای گلبول سفید به شرح زیر است:

1- شمارش تام گلبول‌های سفید در میلی‌متر مکعب خون یا در لیتر

2- شمارش افتراقی به صورت درصد

3- شمارش مطلق هر سلول که حاصلضرب درصد سلول در شمارش کل گلبول‌های سفید است.

4- مرفولوژی گلبول‌های سفید

گلبول‌های سفید طبیعی موجود درخون:

نوتروفیل:

نوتروفیل حدود 40 تا 70 درصد لکوسیت‌های خون در بزرگسالان را تشکیل می‌دهد و دارای هسته‌ای با 2 تا 5 لوب است. نوتروفیل‌های سه و چهار لوبه حدود 80 تا 90 درصد نوتروفیل‌ها و نوتروفیل‌های 5 لوبه کمتر از %5 نوتروفیل‌ها را تشکیل می‌دهند. نوتروفیل‌ها دارای سیتوپلاسمی بیرنگ و آکنده از گرانول‌های خرمایی رنگ هستند. کاهش لوبولاسیون نوتروفیل‌ها در آنومالی پلگر و سندرم‌های پیش سرطانی مشاهده می‌شود. کم گرانول شدن نوتروفیل‌ها همراه با مرفولوژی شبه پلگر از یافته‌های مهم سندرم پیش سرطانی (مایلودیسپلاستیک) است.

گرانولاسیون توکسیک و اجسام دولي از تغییرات مهم نوتروفیل‌ها در عفونت بوده و چنانچه از نمونه بدون ضد انعقاد گستره تهیه شود و واکوئل در نوتروفیل و یا باند مشاهده شود دارای ارزش فراوان در تشخیص عفونت خون می‌باشد. امکان دارد گاهی تکه‌ای از هسته شبیه اجسام هاول‌ژولی از لوب‌های نوتروفیل جدا و در سیتوپلاسم باقی بماند که این حالت در موارد شیمی درمانی و عفونت با HIV گزارش شده است. نوتروفیل با هسته حلقوی به ندرت در افراد سالم و بیشتر در اختلالات مایلوپرولیفراتیو و سندرم‌های پیش سرطانی گزارش شده است.

نوتروفیل با هسته حلقوی و نوتروفیل با تکه جدا شده از هسته شبیه هاول ژولی بادی و نوتروفیل با هسته نکروبیوتیک

دیدن یک نوتروفیل با بیش از 6 لوب و یا دیدن بیش از %5 نوتروفیل 5 لوبه به شرطی که نوتروفیل دارای اندازه بزرگ بوده و کروماتین لوب‌ها باز باشد به عنوان هایپرسگمانته شدن نوتروفیل‌ها گزارش می‌شود که اولین علامت مرفولوژی در کم‌خونی مگالوبلاستیک می‌باشد. گرانول‌های نوتروفیل در آنومالی چدیاک و گاهی در لوسمی حاد میلوبلاستیک (شبه چدیاک) به هم چسبیده و ایجاد گرانول‌های درشت می‌کنند.

نوتروفیل‌های هیپر سگمانته

سلول باند 4-5 درصد گلبول‌های سفید را به خود اختصاص می‌دهد. گفتنی است که تعریف سلول باند در آزمایشگاه‌های مختلف گوناگون است و از این رو برخی از آزمایشگاه‌ها درصد باند را بالا و برخی درصد باند را کم گزارش می‌کنند.

نوتروفیل با زائده درام استیک (Drum Stick)

هسته به شکل U و S و هسته نواری که دارای قطر یکسان در سرتاسر هسته است از مشخصات سلول باند است. اگر فرورفتگی در باند بوجود آید ولی نتوان نام فیلامنت را بر آن گذاشت هنوز جزء باند قلمداد می‌شود.

افزایش سلول باند (شمارش مطلق بیشتر از 500) به ویژه در کودکان و نوزادان علامت عفونت است. گفتنی است که نوزادان به علت تهی شدن سریع مغز استخوان ممکن است پاسخ لکوسیتوز به عفونت را ندهند. باندمی به حالتی گفته می‌شود که تعداد سلول‌های باند به تعداد نوتروفیل نزدیک شود که چنین حالتی در عفونت‌ها و شیگلوز دیده می‌شود.

سلول نوتروفیل با لوب‌های هسته‌ای جدا شده توسط فیلامنت و سلول باند با هسته نعل اسبی

ائوزینوفیل:

ائوزینوفیل حدود یک تا 5 درصد گلبول‌های سفید خون محیطی را تشکیل می‌دهد و شمارش مطلق آن بین 40 تا 550 در میلی‌متر مکعب است. ائوزینوفیل در %80 موارد دو لوبه است و در %20 موارد ممکن است 3 تا 4 لوبه باشد. گرانول‌های نارنجی درشت، سیتوپلاسم را پر می‌کنند.

ائوزینوفیل ممکن است به صورت هایپرسگمانته در کم‌خونی مگالوبلاستیک ناشی از کمبود ویتامین B12 و اسید فولیک و یا به صورت هیپوسگمانته در آنومالی پلگر و یا به صورت حلقوی در اختلالات خونی مشاهده شود.

ائوزینوفیل‌های کم گرانول و واکوئله در سندرم‌های پیش سرطانی و سندرم افزایش ائوزینوفیل مشاهده می‌گردد.

بازوفیل:

بازوفیل دارای هسته لوبوله است ولی پوشش گرانول‌های درشت آبی رنگ، دیدن لوب‌ها را مشکل می‌کند. زمان توقف بازوفیل‌ها در خون 3/7 روز 21± ساعت است که نسبت به سایر گرانولوسیت‌ها بیشتر است. گرانول‌های بازوفیل در آب محلول بوده و از این رو در رنگ گیمسا به سختی قابل رؤیت می‌باشد.

بازوفیل‌های کم گرانول در سندرم‌های پیش سرطانی و اختلالات مایلوپرولیفراتیو مشاهده شده است.

ائوزینوفیل (بالا)، بازوفیل (پایین). گرانول‌های ائوزینوفیل بزرگ و به رنگ نارنجی بوده و معمولاً سطح هسته را نمی‌پوشانند، گرانول‌های بازوفیل بزرگ و شدیداً بازوفیلیک بوده و روی هسته را می‌پوشانند.

لنفوسیت:

لنفوسیت‌ها بین 20 تا 40 درصد از لکوسیت‌های خون محیطی را تشکیل می‌دهند. شمارش مطلق لنفوسیتی بین 960 تا 4400 در هر میلی‌متر مکعب است. تقریباً حدود 10 تا 15 درصد از لنفوسیت‌های گردش خون، سلول‌هایB هستند. حدود %2 از لنفوسیت‌ها سلول‌های کشنده طبیعی (NK cell) و بقیه از نوع T هستند که در میان آن‌ها سلول‌های T کمکی بیشترین درصد را به خود اختصاص می‌دهند.

نکته: روی هم رفته از روی گستره خون محیطی نمی‌توان جمعیت‌های مختلف لنفوسیتی را از هم جدا کرد ولی لنفوسیت‌های NK و لنفوسیت‌های فعال شده T در جمعیت لنفوسیت‌های بزرگ دانه‌دار (LGL) هستند.

لنفوسیت‌ها در سه دسته کوچک (Small)، متوسط (Median) و بزرگ (Large) در خون محیطی مشاهده می‌شوند. لنفوسیت‌های کودکان بزرگتر و متنوع‌تر از بزرگسالان است.

لنفوسیت‌های NK در گروه لنفوسیت‌های بزرگ دانه‌دار قرار می‌گیرند

کروماتین هسته فشرده و یکنواخت، هسته گرد و گاهی دندانه‌دار و تاب‌دار از ویژگی لنفوسیت است. لنفوسیت‌ها ممکن است دارای تعداد محدود و قابل شمارش از گرانول‌های آژروفیل باشند. در لنفوسیت‌های بزرگ دانه‌دار تعداد زیادتری از گرانول‌های درشت آژروفیل که دارای خاصیت پراکسیداز منفی هستند در گوشه‌ای ازسیتوپلاسم قرار دارد.

لنفوسیت کوچک دارای هسته‌ای معادل 8-6 میکرون بوده و از این رو به عنوان راهنمای اندازه طبیعی گلبول قرمز است. توجه داشته باشید که لنفوسیت‌های خون محیطی بر خلاف سلول‌های دیگر سلول‌های پایان بلوغ نیستند بلکه در هنگام برخورد با آنتی‌ژن به اشکال متنوع از جمله سلول‌های شبیه به بلاست تبدیل شده و قابلیت میتوز پیدا می‌کنند و نکته دیگر اینکه بر خلاف سایر سلول‌ها می‌توانند از خون به بافت وارد شده و دوباره از بافت به خون برگردند.

لنفوسیت آتیپیک به شکل پلاسماسایتوئید

منوسیت:

منوسیت دارای قطری معادل 15-20 میکرون است و نظر به اینکه تمایل به چسبیدن و پهن شدن روی شیشه و پلاستیک دارد بزرگتر از نوتروفیل به نظر می‌رسد. منوسیت خون را به سمت بافت‌ها ترک کرده و به ماکروفاژ، استئوکلاست و سلول‌های دندریتیک تبدیل می‌شود.

هسته ممکن است گرد یا بیضی باشد ولی اغلب دارای دندانه عمیق و شبیه نعل اسب است. توجه داشته باشید که منوسیت نعل اسبی را با سلول باند اشتباه نکنید. منوسیت با هسته نعل اسبی دارای هسته پهن و فضای پاراکروماتینی است در حالی که باند مانند نوار باریک بوده و دارای گرانول‌های نوتروفیلی است.

هسته منوسیت دارای کروماتین بنفش رنگ و دارای فضاهای راه راه است که به آن فضای پاراکروماتین گویند. هستک یا بقایای آن ممکن است در منوسیت یافت شود چون در واقع منوسیت سلول نارسی است که در بافت‌ها به تکامل بلوغ می‌رسد. سیتوپلاسم منوسیت آبی خاکستری یا شبیه شیشه مات است و گاهی گرانول‌های آژروفیل شبیه گرد و غبار سیتوپلاسم را می‌پوشاند.

گفتنی است که منوسیت‌ها به سرعت در ضد انعقاد واکوئله می‌شوند و از این رو واکوئله شدن سیتوپلاسم منوسیت‌ها ارزش گزارش ندارد.

بر اساس مطالعات فلوسیتومتری دو زیر گروه منوسیتی CD16⁺ و CD16^– وجود دارد. گفتنی است که منابع ذخیره‌ای منوسیت در مغز استخوان وجود ندارد و این نشان می‌دهد که چرا در بهبودی نارسایی مغز استخوان نخست منوسیت در مغز استخوان ظاهر می‌شود.

شمارش مطلق منوسیتی حدود 800 در میلی‌متر مکعب بوده و بین 1 تا 8 درصد گلبول‌های سفید خون را تشکیل می‌دهد. منوسیتوز در عفونت سل، اندوکاردیت تحت حاد، سندرم‌های پیش سرطانی و در بهبودی مغزاستخوان از نارسایی و بیماری‌های اتوایمیون و مالاریا گزارش شده است.

منوسیت در اشکال مختلف

تفاوت‌های مرفولوژی لنفوسیت و منوسیت:

لنفوسیت و منوسیت جزء سلول‌های تک هسته‌ای بوده و گاهی امکان دارد که لنفوسیت‌های بزرگ با منوسیت اشتباه شوند. توجه به معیارهای زیر در افتراق این دو سلول کمک کننده است.

1- منوسیت بزرگترین سلول تک هسته‌ای در خون محیطی است که دارای هسته‌ای باز با فضای پاراکروماتین به رنگ سفید است ولی هسته لنفوسیت‌ها غالباً دارای کروماتین فشرده بوده و چنانچه فضای پاراکروماتین داشته باشد به رنگ پوست پیازی است.

2- سیتوپلاسم منوسیت در خون EDTAدار به سرعت واکوئله می‌شود و از این رو یافتن واکوئل در سیتوپلاسمی به رنگ خاکستری کدر یا شیشه مات، سلول منوسیت را مطرح می‌کند.

3- سیتوپلاسم منوسیت چنانچه دارای گرانول‌های آژروفیل باشد، گرانول‌ها به صورت پودری و به رنگ بنفش قرمز در تمامی سیتوپلاسم مشاهده می‌شود، در حالیکه گرانول‌های لنفوسیت در صورت حضور درشت و معمولاً در یک گوشه از سیتوپلاسم و غالباً قابل شمارش هستند.

4- سیتوپلاسم لنفوسیت‌ها اندک، روشن و گاهی آبی است. لنفوسیت دارای هسته گرد، گاهی دندانه‌دار و گاهی دارای پیچ و تاب است. هسته منوسیت‌ها گرد، نعل اسبی و گاهی دارای پیچ و تاب فراوان است.

5- جدارسیتوپلاسم لنفوسیت‌ها غالباً منظم و گاهی تحت فشار RBC دارای فرورفتگی است. در حالیکه جدار سیتوپلاسم منوسیت‌ها نامنظم بوده و چندان تحت اثر فشار RBC برای تولید چین خوردگی قرار نمی‌گیرند.

نکته: گلبول‌های قرمز هسته‌دار در بسیاری از آنالیزورها به جای گلبول سفید شمرده می‌شود و در این حالت به عنوان لنفوسیت قلمداد می‌گردد و شمارش افتراقی معکوس می‌دهد؛ بدین معنا که در حضور NRBC همیشه لنفوسیت از نوتروفیل بیشتر است، درچنین مواردی با استفاده از فرمول زیر شمارش گلبول‌های سفید بایستی تصحیح شود:

برای مثال شمارش تصحیح شده گلبول سفید 40000 با %30 گلبول قرمز هسته‌دار برابر است با:

در برخی از آزمایشگاه‌ها شمارش گلبول سفید باNRBC≥10% تصحیح می‌شود، ولی بهتر است که برای هر میزان تصحیح صورت بگیرد.

برای محاسبه شمارش مطلق نوتروفیل درصد نوتروفیل در کل WBC ضرب می‌شود.

برای مثال برایWBC=8000/µlو نوتروفیل %70 شمارش مطلق نوتروفیل برابر با 5600 می‌باشد.

نکته: شمارش مطلق نوتروفیل یا ANC در تمام سنین بیشتر از 1500 تا 2000 در میلی‌متر مکعب است و کمتر از 500 بیمار را مستعد عفونت می‌کند. نرمال شمارش مطلق لنفوسیت 1500-7800 است.

چنانچه شمارش مطلق سلولی نرمال باشد ولی درصد آن افزایش یابد به آن افزایش نسبی گویند. برای مثال شمارش مطلق لنفوسیتی بین 4000- 1500 در میلی‌متر مکعب طبیعی است. حال چنانچه شخصی با شمارش گلبول‌های سفید 3000 در میلی‌متر مکعب دارای %70 لنفوسیت باشد شمارش مطلق لنفوسیتی 2100 است که در طیف طبیعی است. ولی چون درصد آن بالاست افزایش نسبی دارد، ولی چنانچه هر دو بالا باشد به آن لنفوسیتوز گفته می‌شود. برای مثال WBC= 12000 و %80 لنفوسیت به عنوان لنفوسیتوز در نظر گرفته می‌شود.

شمارش مطلق منوسیت بین 800-1000 در میلی‌متر مکعب و شمارش مطلق ائوزینوفیل 500-50 در میلی‌متر مکعب می‌باشد.

مثال: شمارش گلبول سفید بیماری 20000 و دارای %4 ائوزینوفیل است در این حالت شمارش خالص (مطلق) ائوزینوفیل برابر با 800 می‌شود. گرچه در صد طبیعی ائوزینوفیل بین 1 تا 5 درصد است ولی بیمار ائوزینوفیلی دارد.

برای محاسبه AGC یا ANC یا شمارش مطلق نوتروفیلی درصد سلول‌های باند و نوتروفیل در کل WBC ضرب می‌شود.

نکته: اسماج سل بیشتر از %5 اهمیت داشته و به صورت Few و Moderate و Many می‌توان آن را گزارش کرد.

سری نارس نوتروفیلی در شمارش افتراقی با نام سلول گزارش می‌شود. مثلاً بیماری دارای %5 باند و %8 میلوسیت و %2 پرومایلوسیت است. سلول‌های نارس ائوزینوفیل و بازوفیل تحت عنوان سلول نارس (Immature cell) گزارش می‌شوند‌.

مثال: اگر %2 ائوزینوفیل به شکل باند و %3 به صورت متا دیده شود بیمار دارای%5 Immature Eosinophil است. برای گزارش مرفولوژی گلبول‌های سفید به نکات زیر دقت کنید:

گرانولاسیون توکسیک

هیپو سگمانتاسیون

اجسام دولي و واکوئله شدن باند و نوتروفیل

لنفوسیت‌های آتیپیک

میله آور (Auer rod)

هیپرسگمانتاسیون

پارامترهای گلبول‌های قرمز عبارتند از:

1- شمارش گلبول قرمز در میلی‌متر مکعب یا لیتر

2- هموگلوبین (gr/dl)

3- هماتوکریت ( % یا L/L)

4- حجم متوسط گلبول قرمز (MCV بر حسب فمتولیتر)

5- میانگین هموگلوبین در گلبول (MCH بر حسب پیکوگرم)

6- غلظت هموگلوبین در سلول (MCHC بر حسب درصد یا گرم درصد)

7- دامنه پراکندگی حجم (RDW بر حسب درصد یا SD)

8- مرفولوژی گلبول‌های قرمز

پارامتر MCHC ارزش کنترل کیفی دارد. کاهش واقعی آن بیانگر هیپوکرومیا یا استوماتوسیتوز است و افزایش آن در حد 37 یا 38 بیانگر اسفروسیتوز، گلبول‌های داسی شکل و یا بایت سل است.

افزایش غیر قابل قبول MCHC مثلاً بیش از %40 غالباً بیانگر خطای آنالیتیکال از قبیل نمونه‌های هیپرلیپیدمی، نمونه‌های ژاندیس، آگلوتیناسیون‌های سرد و افزایش زیاد گلبول‌های سفید است. غالب موارد فوق با افزایش هموگلوبین، MCHC را افزایش می‌دهند.

پارامتر RDW (Red Cell Distribution Width) از روی هیستوگرام گلبول‌های قرمز به دست می‌آید و پارامتری برای تغییرات اندازه یا آنیزوسیتوز است. هرچه تنوع اندازه RBC بیشتر باشد هیستوگرام گلبول‌های قرمز پهن‌تر و مقدار RDW که بیانگر تغییرات اندازه است وسیع‌تر می‌شود.

مقدار نرمال RDW بر حسب CV برابر است با 14/5– 11/5درصد و بر حسب SD برابر با 3± 42 فمتولیتر است.

با همراه کردن پارامترهای MCV و RDW می‌توان پزشک را در تشخیص یاری داد. برای مثال:

افزایش MCV و RDW در کم‌خونی مگالوبلاستیک ممکن است دیده شود. کاهش MCV و افزایش RDW احتمال آنمی فقر آهن را مطرح می‌کند.

مرفولوژی گلبول‌های قرمز:

تغییرات شکل و اندازه

گزارش مرفولوژی سلول‌های ویژه مانند داسی، اسفروسیت، آکانتوسیت و …

پلی کروماژی

گلبول قرمز هسته‌دار

نکته: در کم‌خونی‌هایی مانند تالاسمی ماژور و آنمی داسی شکل، گلبول‌های قرمز هسته‌دار معمولاً در مراحل ارتو و پلی‌کروم در خون ظاهر می‌شوند. مشاهده اشکال نابالغ‌تر از قبیل پرونرموبلاست و بازوفیلیک نرموبلاست بسیار غیرطبیعی است و امکان بیماری‌های بدخیم مانند سندرم‌های پیش سرطانی یا اریترولوکمی را در بزرگسالان مطرح می‌کند.

همولیز در نوزادان ممکن است با ورود گلبول‌های قرمز در تمام رده‌های بلوغ مشاهده شود.

گلبول‌های پلی‌کروماژی در خون محیطی به مفهوم رتیکولوسیت‌های بسیار نارس(Shift reticulucyte) است. همولیز و خونریزی موجب ورود گلبول‌های پلی‌کروماژی به خون می‌شود.

چنانچه بافر رنگ‌آمیزی اسیدی باشد گلبول‌های قرمز به رنگ قرمزتر از نرمال در آمده و نوتروفیل‌ها به سختی قابل رؤیت و گرانول‌های ائوزینوفیل نارنجی روشن می‌شوند.

پارامترهای پلاکتی عبارتند از:

1- شمارش پلاکت در میلی‌متر مکعب

2- حجم متوسط پلاکتی (MPV)

3- مرفولوژی پلاکت

نکات مهم:

1- کوچک‌ترین ذره لخته در خون موجب کاهش فوق‌العاده پلاکت‌ها می‌شود.

2- هنگام گزارش ترومبوسیتوپنی پدیده اقماری و پدیده تجمع پلاکتی در حضور EDTA را باید مد نظر قرار داد.

3- گلبول‌های شکسته و میکروسیتوز شدید موجب افزایش کاذب پلاکت می‌شود. بیشترین افزایش کاذب پلاکت در بیماری هموگلوبین اچ دیده می‌شود.

4- زمان ایده‌آل برای محاسبه MPV یک تا سه ساعت پس از خون‌گیری است و دامنه طبیعی آن 10/2-6/9 فمتولیتر است.

گزارش مرفولوژی پلاکت:

پلاکت‌های درشت (Large platelet) با حجمی دو برابر پلاکت معمولی

پلاکت‌های غول‌آسا (Giant platelet) به اندازه گلبول قرمز